ACTH重组兔单克隆抗体、制备方法及其应用与流程

本发明涉及抗体，具体涉及acth重组兔单克隆抗体、制备方法及其应用。

背景技术：

1、促肾上腺皮质激素(acth)是下丘脑垂体分泌的重要激素之一，acth的分泌受下丘脑激素促皮质释放因子(crf)和皮质醇的反馈影响。在原发性肾上腺皮质功能不全中，典型表现是acth水平升高，而低水平的acth通常见于垂体功能障碍继发的肾上腺皮质功能不全。acth对于鉴别诊断肾上腺功能减退和分泌亢进及继发性高血压很有价值。acth检测还能帮助鉴别库欣综合症中皮质醇分泌过多的原因，当皮质醇分泌过多是由肾上腺皮质病变或增生引起时，acth水平特征性地降低，而如果是由垂体异位生成acth或acth分泌过多引起时，acth水平是升高的。

2、高血压属于世界性的常见疾病，多发病于春季和冬季。高血压可导致心脏、肾脏和脑血管等部位的病变，是危害人类健康的主要疾病。肾上腺增生性高血压是指病理学基础为肾上腺增生的肾上腺源性的继发性高血压，其诊断需要建立在肾上腺激素分泌增多的基础之上。

3、因此制备特异性强、灵敏度高、亲和力好的acth单克隆抗体，对于提高原发性高血压的诊断率具有重要意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供acth重组兔单克隆抗体、制备方法及其应用，本发明提供了特异性强、灵敏度高、亲和力好的acth重组兔单克隆抗体，以及该抗体的制备方法和应用。

2、本发明提供的acth重组兔单克隆抗体，包含如下氨基酸序列：

3、(1)、其重链的cdr区包含如seq id no:1、2或3所示的氨基酸序列中的至少一个，其轻链的cdr区包含如seq id no:4、5或6所示的氨基酸序列中的至少一个；或

4、(2)、与(1)所示的氨基酸序列中经过氨基酸的取代、添加或缺失一个或多个，但与ⅰ所示氨基酸功能相同或相似的氨基酸序列；或

5、(3)、与(1)或(2)所示的氨基酸序列具备至少80％同源性的氨基酸序列。

6、一些实施中，本发明提供的acth重组兔单克隆抗体，

7、重链的cdr区的氨基酸序列包含如seq id no:1、2或3所示序列中的至少一种；

8、轻链的cdr区的氨基酸序列包含如seq id no:4、5或6所示序列中的至少一种。

9、本发明中，所述acth重组兔单克隆抗体中：

10、ⅰ、其重链的四个fr区其中至少一个fr区具有如seq id no:7、8、9和10所示的氨基酸序列；其轻链的四个fr其中至少一个fr区具有如seq idno:11、12、13和14所示的氨基酸序列。

11、ⅱ、与ⅰ所示的氨基酸序列中经过氨基酸的取代、添加或缺失一个或多个，但与ⅰ所示氨基酸功能相同或相似的氨基酸序列；或

12、ⅲ、与ⅰ或ⅱ所示的氨基酸序列具备至少80％同源性的氨基酸序列。

13、本发明中，所述具有至少80％同源性的序列为在原序列的基础上，经取代、添加或缺失一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列中，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个。

14、一些实施例中，所述acth重组兔单克隆抗体重链的三个cdr区的氨基酸序列依次如seq id no:1、2和3所示；

15、一些实施例中，所述acth重组兔单克隆抗体轻链的三个cdr的氨基酸序列依次如seq id no:4、5和6所示。

16、一些实施例中，所述acth重组兔单克隆抗体重链的四个fr区的氨基酸序列依次如seq id no:7、8、9和10所示；

17、一些实施例中，所述acth重组兔单克隆抗体轻链的四个fr区的氨基酸序列依次如seq id no:11、12、13和14所示。

18、一些具体实施例中，所述acth重组兔单克隆抗体的重链可变区包含seq id no:1、2或3所示的cdr区和seq id no:7、8、9和10所示的fr区。

19、本发明实施例中，所述单克隆抗体的轻链可变区包含seq id no:4、5或6所示的cdr区和seq id no:11、12、13和14所示的fr区。

20、在一些具体实施例中，所述acth重组兔单克隆抗体的重链可变区具有如seq idno:15所示的氨基酸序列；轻链可变区具有如seq id no:16所示的氨基酸序列。

21、本发明提供的acth重组兔单克隆抗体还包括恒定区，所述重链的恒定区为兔的igg亚型；所述轻链的恒定区为κ1型。

22、本发明利用噬菌体展示技术筛选并获得了本发明所述的acth重组兔单克隆抗体，该抗体的特异性强、灵敏度高、亲和力好。解决了促肾上腺皮质激素在样本中含量低、检测难度大的问题。经鉴定，利用该单抗进行重复多次检测，稳定性良好，准确性高。

23、本发明提供了生物材料，其包括以下至少一项：

24、1)、编码所述的acth重组兔单克隆抗体的核酸；

25、2)、包含所述核酸的表达载体；

26、3)、转化或转染所述表达载体的宿主细胞；

27、4)、所述的acth重组兔单克隆抗体与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物；

28、5)、经化学标记或生物标记的所述的acth重组兔单克隆抗体；

29、6)、所述经化学标记或生物标记的acth重组兔单克隆抗体与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。

30、本发明对所编码所述抗体的核酸序列不做限定，凡能编码本发明所述抗体的核酸皆在本发明的保护范围之内。在一些具体实施例中，所述核苷酸具有与seq id no:17和seqid no:18所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的、且与seq idno:17和seq id no:18所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。更具体的，所述核酸包括：编码重链可变区的核酸具有如seq id no:17所示的核苷酸序列；编码轻链可变区的核酸具有如seq id no:18所示的核苷酸序列。

31、本发明提供了所述的acth重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：培养所述的宿主细胞，诱导所述acth重组兔单克隆抗体的表达。

32、在一些具体实施例中，所述的表达载体为rgfc-pcmv3或rcl-pcmv3。

33、在一些具体实施例中，所述的宿主细胞选自大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞。优选的，所述的宿主细胞为哺乳动物hek293细胞。

34、所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物；所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。所述酶标记优选为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。所述免疫毒素优选为黄曲霉毒素、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思子毒蛋白、槲寄生凝集素、蒴莲根毒素、pap、造草素、白树毒素或丝瓜毒素

35、所述固相介质或半固体介质是指本发明所述的重组抗体、经标记的重组抗体能够附着至其上的任何支持物，包括但不限于硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯(pvdf)膜、ipdms芯片、微孔板、聚苯乙烯平板、微粒、微载体、凝胶等。

36、本发明所述的acth重组兔单克隆抗体、生物材料和/或经宿主细胞表达的acth重组兔单克隆抗体在制备检测高血压相关疾病的试剂或试剂盒中的应用。

37、在一些具体的实施例中，所述检测高血压相关疾病的指标为检测促肾上腺皮质激素水平。

38、实验表明，本发明提供的acth重组兔单克隆抗体能够作为检测抗体应用于促肾上腺皮质激素的检测，且具有良好的灵敏度。本发明提供的acth重组兔单克隆抗体适用于促肾上腺皮质激素的免疫学检测。一些实施例中，所述促肾上腺皮质激素的检测采用磁微粒化学发光法。

39、本发明提供了检测试剂或检测试剂盒，其包括本发明所述的acth重组兔单克隆抗体、所述生物材料和/或所述宿主细胞表达的acth重组兔单克隆抗体。

40、所述检测试剂或检测试剂盒还包括可接受的助剂、缓冲液、辅料或载体。

41、一些实施例中，所述试剂盒适用于促肾上腺皮质激素的磁微粒化学发光。

42、本发明还提供了一种高血压相关疾病的检测方法，其包括采用本发明的检测试剂或检测试剂盒对样本进行检测。

43、本发明利用噬菌体展示技术，筛选获得了本发明所述的acth重组兔单抗，其重链可变区具有如seq id no:15所示的氨基酸序列；其轻链可变区具有如seq id no:16所示的氨基酸序列。该单抗特异性强，检测灵敏度高，亲和力好，解决了促肾上腺皮质激素在样本中含量低、检测难度大的问题。经鉴定，利用该单抗进行重复多次检测，稳定性良好，准确性高。