一种混合微生物菌剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及微生物菌剂，特别是涉及一种混合微生物菌剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、辣椒是一种茄科辣椒属植物，在全国普遍栽培，是一种大众化蔬菜，也可药用。辣椒菌核病是由核盘菌引起的、发生在辣椒的病害。主要危害茎基部，也能危害茎、叶和叶柄、花、果实和果柄。辣椒菌核病可发生在辣椒的整个生育期，但主要发生在辣椒开花期至挂果期，引起全株性枯萎死亡。

2、辣椒菌核病是对辣椒生产、制种的毁灭性病害，在中国各地均有发生，在温度湿度适合菌核病发生、蔓延的情况下，发病率25%-30%，严重地块病株率高达40%以上，辣椒种子减产20-30%，可给农户造成严重的经济损失。

3、辣椒菌核病病原菌核盘菌，属子囊菌亚门真菌。菌核初为白色，老熟后变黑色鼠粪状，由菌丝体扭集在一起形成。子囊盘浅褐色，盘状或扁平状。子囊盘柄的长度3～15mm，伸出土面为乳白色，渐展开呈杯状。子囊盘成熟后子囊孢子呈烟雾状弹射。子囊棍棒状，无色，内生子囊孢子8个。子囊孢子单胞，无色，椭圆形，大小(10～15)μm×(5～10)μm。菌丝生长及菌核形成最适温度20℃，最高35℃。这种病原菌可以侵染茄科、葫芦科等多种蔬菜。

4、核盘菌的防治方法包括化学、农业和生物防治。化学防治中常用的杀菌剂有多菌灵、菌核净、速克灵、戊唑醇等。在生产上，多菌灵的化学防治效果较好，但近几年研究发现其效果随寄主植物品种抗性的增强已呈现出不理想的状态，核盘菌在许多地区对多菌灵已产生抗药性。常用的农业防治有：釆用科学的栽培措施如种子处理、拉大行间距等避免或减少菌核病的发生，深翻土壤埋藏菌核以减少子囊盘萌发，歇田期灌水使菌核腐烂等。这些常规农业方法能控制部分菌核病的发生，但核盘菌寄主范围广泛，病菌可以菌核形式长期存活于土壤中，所以轮作、田园清洁等传统农业防治技术在规模化生产中很难取得较好的防治效果。生物防治高效且无毒、无害、无污染、不产生抗药性，不仅符合人们对绿色食品的需求，而且为农业的可持续发展提供了保障。因此，筛选一种核盘菌的拮抗混合微生物菌剂应用于实践生产中迫在眉睫。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中缺乏对核盘菌具有高效防治效果的绿色制剂，而提供一种混合微生菌剂。

2、本发明的另一目的，提供一种所述混合微生物菌剂的制备方法。

3、本发明的另一目的，提供一种所述混合微生物菌剂的应用。

4、为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

5、一种混合微生物菌剂，包括哈茨木霉（ trichoderma harzianum）和解淀粉芽孢杆菌（ bacillus amyloliquefaciens），所述混合微生物菌剂应用于菌核病的防治。

6、所述哈茨木霉保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc）(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微 生物研究所，邮政编码：100101)，保藏号为cgmcc no.40350，保藏日期为2022年10月28日；

7、所述解淀粉芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc）(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微 生物研究所，邮政编码：100101)，保藏号为cgmcc no.25986，保藏日期为2022年10月28日。

8、在上述技术方案中，所述哈茨木霉的有效活菌数≥2.0*108个/g，所述解淀粉芽孢杆菌产品有效活菌数≥2.0*1010个/g。

9、在上述技术方案中，所述哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌的体积比为1:1~1:3，优选为1:2。

10、在上述技术方案中，所述混合微生物菌剂通过以下方法制备：制备哈茨木霉、制备解淀粉芽孢杆菌和混合制备所述混合微生物菌剂；

11、其中，哈茨木霉通过以下方法制备：

12、步骤1，一级种子培养：培养活化后的哈茨木霉菌株；

13、步骤2，发酵:发酵培养基灭菌后，刮取步骤1得到的一级种子菌苔后在无菌水中混匀，接种在哈茨木霉液体发酵培养基中，维持溶解氧浓度10%-20%，控制罐压在0.02 mpa-0.07 mpa，在28℃培养60h；

14、步骤3，待步骤2中的哈茨木霉的孢子比例≥90%时，结束发酵，放罐，得到哈茨木霉发酵液；

15、步骤4，将步骤3得到的所述发酵液与稳定剂复合制成哈茨木霉液体制剂；

16、步骤5，将所述哈茨木霉液体制剂进行浓缩喷干，得到粉末状哈茨木霉。

17、在上述技术方案中，所述解淀粉芽孢杆菌通过以下方法制备：

18、步骤s1，一级种子培养：培养活化的解淀粉芽孢杆菌；

19、步骤s2，发酵:发酵培养基灭菌后，刮取步骤s1得到的一级种子菌苔后在无菌水中混匀，接种在解淀粉芽孢杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02 mpa-0.07 mpa，在35℃培养26h；

20、步骤s3，待步骤s2中的解淀粉芽孢杆菌的孢子比例≥90%时，结束发酵，放罐，得到解淀粉芽孢杆菌发酵液；

21、步骤s4，将所述解淀粉芽孢杆菌发酵液与稳定剂复合制成解淀粉芽孢杆菌液体制剂；

22、步骤s5，将所述解淀粉芽孢杆菌液体发酵液进行浓缩喷干，得到粉末状解淀粉芽孢杆菌。

23、在上述技术方案中，所述混合制备混合微生物菌剂包括以下步骤：将所述粉末状解淀粉芽孢杆菌和粉末状哈茨木霉按体积比1:2混合，得到所述混合微生物菌剂。

24、在上述技术方案中，所述哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌均通过试管斜面活化。

25、本发明的另一方面，提供一种所述的混合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

26、步骤a1，制备哈茨木霉；

27、步骤a1.1，一级种子培养：培养活化后的哈茨木霉菌株；

28、步骤a1.2，发酵:发酵培养基灭菌后，刮取步骤a1.1得到的一级种子菌苔后在无菌水中混匀，接种在哈茨木霉液体发酵培养基中，维持溶解氧浓度10%-20%，控制罐压在0.02mpa-0.07 mpa，在28℃培养60h，发酵所用培养基的原料及用量为: 糖蜜2%，酵母粉0.5%，氯化亚铁0.01%，硫酸镁0.125%，磷酸二氢钾0.4%，硝酸钠0.7% ，ph5.5～6.0，消泡剂3%；

29、步骤a1.3，待步骤a1.2中的哈茨木霉的孢子比例≥90%时，结束发酵，放罐，得到哈茨木霉发酵液；

30、步骤a1.4，将步骤a1.3得到的所述哈茨木霉发酵液与稳定剂复合制成哈茨木霉液体制剂；

31、步骤a1.5，将所述哈茨木霉液体制剂进行浓缩喷干，得到粉末状哈茨木霉，包装；

32、步骤a2，制备解淀粉芽孢杆菌；

33、步骤a2.1，一级种子培养：培养活化的解淀粉芽孢杆菌；

34、步骤a2.2，发酵:发酵培养基灭菌后，刮取步骤a2.1得到的一级种子菌苔后在无菌水中混匀，接种在解淀粉芽孢杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02 mpa-0.07 mpa，在35℃培养60h，发酵所用培养基的原料及用量为:葡萄糖1%，糖蜜2%，玉米浆1.5%，氯化钠0.1%，碳酸钙1%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.05%，氯化亚铁0.002%，ph7.0～7.5，消泡剂3%；

35、步骤a2.3，待步骤a2.2中的解淀粉芽孢杆菌的芽孢比例≥90%时，结束发酵，放罐，得到解淀粉芽孢杆菌发酵液；

36、步骤a2.4，将所述解淀粉芽孢杆菌发酵液与稳定剂复合制成解淀粉芽孢杆菌液体制剂；

37、步骤a2.5，将所述解淀粉芽孢杆菌液体发酵液进行浓缩喷干，得到粉末状解淀粉芽孢杆菌，包装；

38、步骤a3，将所述粉末状解淀粉芽孢杆菌和粉末状哈茨木霉按体积比1:2混合，得到所述混合微生物菌剂。

39、本发明的另一方面，提供一种所述的混合微生物菌剂在防治辣椒菌核病中的应用，防效不低于88%。

40、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

41、1.本发明的混合微生物菌剂对引起辣椒菌核病核盘菌拮抗效果明显，能防止或减轻辣椒菌核病的发生，促进辣椒稳产，保障产品的产量和品质。

42、2.本发明的混合微生物菌剂用在苗期盆栽防治辣椒菌核病，防治效果可以达到88%。绿色环保制剂、安全无残留、能大幅度降低农药使用量从而降低农业生产成本，其大面积推广使用的前景十分广阔。

43、本发明中：所述哈茨木霉保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc）(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏号为cgmcc no.40350，保藏日期为2022年10月28日。

44、所述解淀粉芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc）(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏号为cgmcc no.25986，保藏日期为2022年10月28日。