METTL3过表达载体及干扰细胞系的构建方法

本发明涉及一种基因过表达载体的构建及干扰细胞系建立，具体涉及mettl3过表达载体及干扰细胞系的构建方法。

背景技术：

1、mettl3在细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移和侵袭、细胞分化、炎症反应、代谢和先天免疫等各种生物学过程中发挥着重要作用。在脂多糖(lipopolysaccharide，lps)诱导的ipec-j2细胞中，敲低mettl3可降低traf6mrna的m6a水平，抑制traf6出核，降低traf6蛋白表达水平，从而抑制nf-κb和mapk等信号通路介导的炎症反应。在e.colik88感染ipec-j2细胞中，m6a甲基转移酶mettl3调控β-防御素的产生，敲低mettl3降低了对防御素的诱导，而过表达mettl3有力地刺激了防御素的重新表达，从机制上讲，转录因子foxo6与mettl3相互作用触发gpr161的转录和对β-防御素表达的调控。另外，在用大肠杆菌f18(escherichiacolif18，e.colif18)感染ipec-j2细胞中发现m6a甲基化转移酶mettl3可能通过介导m6a修饰来提高关键靶基因ikbkg表达水平，进而激活tlrs免疫信号通路，最终在一定程度上提高断奶仔猪对e.colif18的抵抗能力。mettl3可使mir-1246发生甲基化，进而调控靶基因spred2和mapk信号通路促进结直肠癌转移[。mettl3在人牙髓细胞和成骨细胞中也被报道通过激活nf-κb、mapk信号通路分子的磷酸化，促进lps诱导的炎症反应。在类风湿性关节炎中，mettl3通过nf-κb信号通路减弱lps诱导的巨噬细胞炎症反应。以上结果表明mettl3在肠道疾病或其他疾病炎症反应中发挥着重要作用，但mettl3在cpb2诱导ipec-j2细胞所致炎症反应的作用机制尚未清楚。因此，建立mettl3过表达载体是研究cpb2诱导ipec-j2细胞所致炎症反应的基础。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了mettl3过表达载体及干扰细胞系的构建方法。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、mettl3过表达载体的构建方法，包括如下步骤：

4、s1、基于nebcutterv2.0软件实现mettl3(xm_003128580)cds区存在的限制性内切酶，与pcdna3.1(+)过表达载体中限制性内切酶的分析比较，确定特意的限制性内切酶，利用ncbi中primer-blast软件分别设计含特异限制性内切酶的mettl3，并进行引物合成；其中：

5、f:ggtaccggtaccatgtcggacacgtggagc；

6、r:ccgctcgagctataaattcttaggtttagagat；

7、s2、pcr扩增：

8、以ipec-j2细胞的cdna为模板，pcr反应体系：cdna模板2.0μl，上游引物f(10μmol/l)1.0μl，下游引物r(10μmol/l)1.0μl，2×taqpcrmaster mix10μl，rnafreewater6.0μl；pcr反应程序：第一步95℃起始变性5min，第二步94℃解链30s，第三步55℃退火30s，第四步72℃延伸2min，其中解链到延伸循环次数为35次，第五步72℃最终延伸10min，第六步4℃保存；进行pcr扩增；

9、s3、pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带，按照dna凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收；

10、s4、将胶回收的mettl3片段和pcdna3.1(+)质粒使用限制性内切酶mettl3(kpni、xhol)进行双酶切，反应体系：10×greenbuffer2.0μl，restrictionenzyme(kpni)1.0μl，restrictionenzyme(xhol)1.0μl，dna≤1μg，rnasefreewater补齐至20μl；反应条件：37℃，水浴10min，酶切后琼脂糖凝胶电泳检测；

11、s5、将酶切产物，用t4dna连接酶16℃水浴锅中过夜连接，连接体系：mettl3或wnt9a片段15μl，pcdna3.1(对应酶切位点切开)2μl；t4dna buffer2μl；t4dna连接酶1μl；即可获得mettl3过表达重组质粒；

12、s6、将构建的载体质粒转化至dh5α感受态细胞中冰浴30min，然后42℃金属浴热激90s，再冰浴5min，加入900μl不含抗生素的lb培养基，混合均匀后37℃摇床培养1h，取出后5000rpm/min，离心3min，弃上清800μl，将剩余的100μl混匀后，吸取50μl涂布在含氨苄的lb固体培养基上，37℃倒置培养16h，挑单菌至含氨苄的液体培养基中，37℃摇床，200rpm/min，培养12h，提取的质粒用所对应的限制性内切酶酶切鉴定，鉴定成功的质粒通过质粒提取试剂盒扩大提取，-20℃保存。

13、本发明还提供了mettl3干扰细胞系的建立方法，包括如下步骤：

14、s1、根据mettl3cds全长序列，使用设计使用sidirect及invivogen网络在线软件设计si-mettl3序列，并在ncbi上blast比较，选择1对si-mettl3干扰序列序列：

15、f：gacggaucaucaauaaacatt

16、r：uguuuauugaugauccguctt

17、s2、细胞转染：

18、(1)将生长良好的ipec-j2细胞，pbs清洗，胰酶消化后收集于ep管中1000rpm离心5min，并用完全培养基重悬后接种于细胞培养板中，过夜培养待细胞密度达70％时开始转染；

19、(2)将待转染细胞用pbs清洗2～3次，加入适量的opti-mem培养基，放入37℃培养箱继续培养；

20、(3)准备2支离心管将dna/sirna和opti-mem培养基、lipofectamine2000和opti-mem培养基分别混匀避光静置5min后，再将两管试剂合并混匀避光室温静置20min；

21、(4)将混合物慢慢分散加入对应的孔中混匀，置于培养箱中孵育4～6h后更换无抗完全培养基，培养24h或48h；

22、s3、干扰rna细胞系建立：

23、荧光标记sirna检测转染效率：根据上海吉玛公司提供的荧光标记sirna，分别按照50nm、100nm、150nm和200nm浓度转染至ipec-j2细胞，6h观察荧光信号。

24、上述方案中，提供了利用pcdna3.1过表达空载体构建mettl3过表达载体的方法，根据mettl3mrna序列设计sirna，将其转染至猪小肠上皮细胞中，通过rt-qpcr和westernblot进行验证，能够生产mettl3过表达、si-mettl3在猪小肠上皮细胞中表达降低至50％以下，证实mettl3过表达载体和sirna猪小肠上皮细胞系建立成功。该发明为后期研究猪小肠上皮细胞中mettl3的功能提供了基础。