一种新型分子标志物在乳腺癌诊断或预后评估中的应用

本发明属于生物技术和医学诊断领域，涉及一种新型分子标志物在乳腺癌诊断或预后评估中的应用，具体涉及一种与乳腺癌相关的长非编码rna之筛选方法及其用途。

背景技术：

1、全基因组转录组研究表明蛋白质编码区仅占人类基因组序列的2％，90％以上的序列被转录成不控制蛋白质合成的非编码rna(ncrna)。长非编码rna(lncrnas)是一类长度超过200个核苷酸的转录物，其特点是类型多、作用模式多和数量多，具有空间和时间特异性，可在多种层面调节基因的表达，参与多种生物学过程，如增殖、凋亡、转移、代谢和耐药性等。越来越多的证据显示，lncrna表达量的异常及其遗传多态性与肿瘤的发生、发展密切相关，因此lncrna有望成为新型肿瘤诊断标志物和治疗靶点，用于肿瘤诊断、治疗和复发的监测等。

2、根据全球癌症统计报告(global cancer observatory)所公布2020年的数据中，乳腺癌已成为发病率最高的癌症类型。国家癌症中心2022年2月发布的全国癌症报告显示乳腺癌居我国癌症发病的第四位，更是女性癌症发病的首位，年发病率亦稳步上升。根据雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)、人表皮生长因子受体2(her2)和ki67的表达情况，可将乳腺癌患者分为4种亚型：管腔细胞a(luminal a)、管腔细胞b(luminal b)、her2阳性和三阴性乳腺癌(tnbc)。其中三阴性乳腺癌(er、pr及her2均阴性)缺乏激素受体，在乳腺癌病例中约占15％，对靶向治疗和内分泌治疗不敏感。70％以上的三阴性乳腺癌患者在手术后3年内出现复发，导致预后不佳。鉴于此，寻找和鉴定敏感、特异的新型乳腺癌分子标志物及其检测方法来诊断或辅助诊断乳腺癌，对于指导临床治疗与判断预后具有重要的意义，有着广泛的应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种可用于乳腺癌预后评估、诊断、辅助诊断、筛查、风险评估和/或术后复发或转移风险评估的分子标志物，和/或，提供一种乳腺癌治疗靶点。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为了实现上述目的，本发明首先提供了分子标志物和/或检测所述分子标志物的物质的下述任一种应用：

3、a1)在乳腺癌诊断或制备用于乳腺癌诊断的产品中的应用；

4、a2)在乳腺癌辅助诊断或制备用于乳腺癌辅助诊断的产品中的应用；

5、a3)在乳腺癌筛查或制备用于乳腺癌筛查的产品中的应用；

6、a4)在乳腺癌预后评估或制备用于乳腺癌预后评估的产品中的应用；

7、a5)在评估乳腺癌风险或制备用于评估乳腺癌风险的产品中的应用；

8、a6)在评估乳腺癌术后复发或转移风险或制备用于评估乳腺癌术后复发或转移风险的产品中的应用；

9、a7)在预防或治疗乳腺癌或制备预防或治疗乳腺癌的药物中的应用；

10、a8)在预防或治疗三阴性乳腺癌或制备预防或治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用；

11、a9)在抑制乳腺癌细胞增殖或制备抑制乳腺癌细胞增殖的试剂或药物中的应用；

12、a10)在抑制乳腺癌细胞迁移、转移、扩散和/或侵袭或制备抑制乳腺癌细胞迁移、转移、扩散和/或侵袭的试剂或药物中的应用；

13、所述分子标志物可为lncrna(长非编码rna)，名称可为livar(liver cellviabilityassociated lncrna)，所述lncrna livar可为下述任一种：

14、b1)核苷酸序列是seq id no.1的rna；

15、b2)来源于人且与b1)具有80％以上的同一性的多核苷酸；

16、优选地，所述乳腺癌可为三阴性乳腺癌。

17、进一步地，所述lncrna livar在乳腺癌患者中的表达水平显著上调，且livar的高表达与较差的乳腺癌预后显著相关。所述lncrna livar可以作为分子标志物用于乳腺癌的诊断、辅助诊断、筛查、预后评估、风险评估或术后复发或转移风险评估等分子诊断领域。

18、进一步地，编码lncrna livar的基因为livar基因，所述livar基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。

19、进一步地，所述lncrna livar可为人源的。

20、本文中，同一性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

21、本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

22、上述应用中，所述检测所述分子标志物的物质可包括通过逆转录-聚合酶链反应、实时荧光定量pcr技术、转录组测序技术、northern blot、原位杂交技术、基因芯片技术、nanopore测序技术或pacbio测序技术检测所述分子标志物的试剂和/或仪器。

23、上述应用中，所述检测所述分子标志物的物质可为检测所述lncrna livar表达水平的试剂和/或仪器。

24、进一步地，所述检测所述lncrna livar表达水平的试剂包括特异性识别lncrnalivar的探针，和/或，特异性扩增lncrna livar的引物。

25、进一步地，所述检测所述lncrna livar表达水平的试剂包括特异性识别livar基因的探针，和/或，特异性扩增livar基因的引物。

26、所述探针可为dna探针、rna探针、cdna探针、crna探针或寡核苷酸探针。

27、本发明还提供了用于乳腺癌诊断、辅助诊断、筛查、预后评估、风险评估或术后复发或转移风险评估的试剂盒，所述试剂盒可包括本文中任一所述检测所述分子标志物的物质。

28、进一步地，所述试剂盒的检测样本可为血液样本(如全血、血浆、血清)、组织样本、唾液样本、痰液样本、体液样本等但不限于此。

29、所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。

30、本发明还提供了抑制所述分子标志物表达的物质的下述任一种应用：

31、c1)在预防或治疗乳腺癌或制备预防或治疗乳腺癌的药物中的应用；

32、c2)在预防或治疗三阴性乳腺癌或制备预防或治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用；

33、c3)在抑制乳腺癌细胞增殖或制备抑制乳腺癌细胞增殖的试剂或药物中的应用；

34、c4)在抑制乳腺癌细胞迁移、转移、扩散和/或侵袭或制备抑制乳腺癌细胞迁移、转移、扩散和/或侵袭的试剂或药物中的应用。

35、进一步地，所述抑制所述分子标志物(lncrna livar)表达可通过本领域技术人员所熟知的技术实现，例如通过反义寡核苷酸aso实现lncrna的敲低，通过质粒或者病毒递送的shrna或sirna实现lncrna的敲低，以及利用crispri(基因抑制/沉默)技术抑制lncrna的表达等。

36、进一步地，所述抑制所述分子标志物表达的物质包括但不限于核酸分子、碳水化合物、小分子化合物、基因编辑载体、慢病毒或腺相关病毒中的一种或多种。

37、进一步地，所述核酸分子包括但不限于反义寡核苷酸(如反义rna)、双链rna(dsrna)、小干扰rna(sirna)、微小rna(microrna)或短发夹rna(shrna)。

38、进一步地，所述反义寡核苷酸(如反义rna)、双链rna(dsrna)、小干扰rna(sirna)、微小rna(microrna)或短发夹rna(shrna)用于抑制所述分子标志物(lncrna livar)表达。

39、所述反义寡核苷酸是指可与靶基因(lncrna livar或livar基因)互补的核酸片段，可以通过碱基互补原则结合于靶基因上，从而抑制、封闭、或降低lncrna livar的表达，所述反义寡核苷酸可为反义dna或反义rna，可通过本领域技术人员公知的方法人工合成或体内表达；所述双链rna(dsrna)、小干扰rna(sirna)、微小rna(mirna)或短发夹rna(shrna)是指通过rna干扰(rnai)来抑制或降低lncrnalivar表达的rna，可以通过本领域技术人员公知的方法来制备。

40、上述应用中，所述抑制所述分子标志物表达的物质包括沉默或敲除livar基因的物质，所述livar基因可为编码所述分子标志物lncrna livar的基因。

41、进一步地，所述livar基因的核苷酸序列可如seq id no.4所示。

42、上述应用中，所述沉默或敲除livar基因的物质可包括但不限于sirna、sgrna、microrna、shrna和/或反义寡核苷酸。

43、上述应用中，所述sirna可为si-livar，所述si-livar的正义链的核苷酸序列可为seq id no.2，反义链的核苷酸序列可为seq id no.3。

44、本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物可包括本文中任一所述的抑制所述分子标志物表达的物质，所述药物组合物可具有下述至少一种用途：

45、d1)预防或治疗乳腺癌；

46、d2)预防或治疗三阴性乳腺癌；

47、d3)抑制乳腺癌细胞增殖；

48、d4)抑制乳腺癌细胞迁移、转移、扩散和/或侵袭。

49、进一步地，所述药物组合物还可包括一种或者是多种药学上可接受的载体。

50、所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。

51、本发明还提供了用于乳腺癌诊断、辅助诊断、筛查、预后评估、风险评估或术后复发或转移风险评估的装置，所述装置可包括本文中任一所述检测所述分子标志物的物质和存储有计算机程序的计算机可读存储介质，所述计算机程序使计算机执行如下步骤：根据样本中所述分子标志物的表达水平进行乳腺癌的诊断、辅助诊断、筛查、预后评估、风险评估或术后复发或转移风险评估。

52、本文所述乳腺癌可为三阴性乳腺癌。

53、本文中，所述产品包括但不限于试剂、试剂盒、芯片、试纸、检测卡、高通量测序平台或生物传感器。

54、本文所述产品可包括本文中任一所述检测所述分子标志物的物质。

55、本发明还提供了诊断、辅助诊断或筛查乳腺癌的方法，所述方法可包括：从受试者获得待测样品，然后利用本文中任一所述检测所述分子标志物的物质检测所述待测样品中所述分子标志物(lncrna livar)的表达水平，根据所述分子标志物的表达水平进行乳腺癌的诊断、辅助诊断或筛查。

56、本发明还提供了乳腺癌预后评估、风险评估或术后复发或转移风险评估的方法，所述方法可包括：从受试者获得待测样品，然后利用本文中任一所述检测所述分子标志物的物质检测所述待测样品中所述分子标志物(lncrna livar)的表达水平，根据所述分子标志物的表达水平进行乳腺癌的预后评估、风险评估或术后复发或转移风险评估。

57、本发明还提供了预防或治疗乳腺癌的方法，所述方法可包括向受试者施用本文中任一所述的抑制所述分子标志物(lncrna livar)表达的物质，或所述药物组合物。

58、上述方法中，所述受试者可包括患有乳腺癌疾病的患者。

59、上述方法中，所述乳腺癌可包括三阴性乳腺癌、管腔a型乳腺癌、管腔b型乳腺癌或her2阳性乳腺癌。

60、所述分子标志物(lncrna livar)也在本发明的保护范围内。

61、本文中任一所述检测所述分子标志物的物质也在本发明的保护范围内。

62、本文中任一所述的抑制所述分子标志物表达的物质也在本发明的保护范围内。

63、本发明还提供了本文中任一所述的抑制所述分子标志物表达的物质，用于预防或治疗乳腺癌。

64、上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。

65、本发明的目的在于，针对现有技术之缺陷，提供一种与乳腺癌相关的新型分子标志物，可用于此类诊断方法的试剂盒和装置。本发明开发的分子标志物可为与乳腺癌诊断、预后相关的分子靶标livar(liver cell viability associated lncrna)，是一可靠的分子标志物，可应用至乳腺癌预后的检测评估的试剂盒制备，对乳腺癌患者进行诊断与监测等，以及确定进一步的治疗方法，提高疗效。

66、本发明人经过广泛而深入的研究，通过对公共数据库中的数据进行挖掘，发现长非编码rna livar在乳腺癌患者中的表达水平显著上调，且livar的高表达与乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)不良预后显著相关，并基于此开发了可用于乳腺癌的诊断、辅助诊断、筛查、预后评估、风险评估或术后复发或转移风险评估等分子诊断领域的分子标志物。由kaplan-meier生存分析结果，可以看出livar的高表达与乳腺癌不良预后相关。细胞迁移与增殖等表型实验进一步证明livar与乳腺癌细胞的增殖和迁移相关。总之，本发明鉴定了一种乳腺癌诊断及预后预测因子livar，可用於评估患者存在乳腺癌或在后续时间内发展该疾病的可能性。

67、本发明还通过设计靶向livar基因的sirna作为抑制本发明分子标志物(lncrnalivar)表达的物质，用于敲低livar基因的表达，结果进一步验证了敲低livar基因，抑制livar基因的表达可明显抑制乳腺癌细胞迁移和/或侵袭能力，并能显著抑制乳腺癌细胞的增殖。表明livar能影响乳腺癌细胞的增殖，可以作为乳腺癌治疗的药物靶点，抑制livar表达的物质可以用于制备治疗乳腺癌的药物，同时进一步验证了用于检测livar的物质可以应用于乳腺癌的诊断、辅助诊断或预后。

68、综上，本发明用于诊断、辅助诊断或预后评估的乳腺癌分子标志物lncrna livar和抑制该分子标志物表达的物质的开发对于乳腺癌的诊断、预后及风险预测具有重要的临床应用价值。