EGCG联合CHK2抑制剂在改善卵成熟或胚胎发育中的应用

本发明涉及egcg联合chk2抑制剂在改善卵成熟或胚胎发育中的应用，属于哺乳动物的辅助生育。

背景技术：

1、生殖健康对维持人口的持续性至关重要，然而随着人类所处的自然环境与社会环境的持续变化，生育问题日趋严峻，全球不孕症患病率不断增加。为解决不孕不育夫妇的生育困境，辅助生殖技术应运而生并飞速发展，在世界范围得到广泛应用。然而，目前辅助生殖技术成功妊娠率仍较低，亟需研究者们进一步改进胚胎培养体系。

2、随着年龄的增长，卵巢中卵母细胞的数量和质量下降，并伴有卵巢内分泌功能受损，这种与年龄相关的生育率下降被称为生殖衰老。目前随着我国生育政策的放开，高龄生育占比突增，但高龄女性卵母细胞质量下降，导致不孕率高、流产率高、出生缺陷防控难。如何提升高龄女性卵母细胞质量，是亟需解决的重要难题。已知氧化应激、线粒体缺陷、减数分裂染色体分离错误、遗传突变等是导致高龄女性卵母细胞质量下降的重要因素，针对这些原因探索针对性的治疗药物或干预方案将为未来高龄女性助孕提供有效措施。

3、近几十年来，卵母细胞体外成熟培养(ivm)、体外受精-胚胎移植(ivf-et)等辅助生殖助孕技术的应用为广大不孕不育患者带来了希望，但存在卵母细胞和胚胎发育潜能不足、成功妊娠率较低等问题，且随着助孕年龄增加，助孕效果越差。深入探索改善辅助生殖助孕技术的方法，提高助孕成功率，将造福广大不孕症患者。目前，本领域迫切需要能够在卵和胚胎的体内或体外培育中增强卵母细胞成熟和胚胎发育潜能的方法和培养基，从而改善哺乳动物特别是老年哺乳动物的受精能力与妊娠结局。

4、表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-epigallocatechin gallate，egcg]是绿茶中含量最多的多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生物学效果。多项研究表明，egcg在预防和治疗肿瘤、糖尿病、心血管疾病和神经系统疾病等慢性疾病中发挥重要作用。

5、谷亚轻硕士的硕士论文《表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)对小鼠卵母细胞体外成熟，受精及胚胎发育的影响》通过添加不同浓度的egcg来研究其对小鼠卵母细胞体外成熟，受精及其后期胚胎发育的影响，结果发现：在htf体系中，培养cocs时egcg的添加量20μm，可以显著提高卵母细胞的成熟率，以及后期受精卵和胚胎发育率。在htf体系中，添加egcg对do(裸卵)作用不明显，不能提高卵母细胞的成熟率，对于受精卵和胚胎发育率的影响不大，过量添加egcg可以显著降低卵母细胞的成熟率，受精卵和胚胎发育率。但其研究对象是年轻卵，egcg对老年卵母细胞的成熟率、体内体外发育结局如何，尚不清楚。

6、细胞周期检查点激酶2(checkpoint kinase 2，chk2)是dna损伤修复通路中重要的信号转导蛋白，可使受损的dna得以修复并维持染色体的稳定性。通过chk2抑制剂增强肿瘤细胞对dna损伤的敏感性在肿瘤治疗领域广泛研究。bml-277是一种细胞周期检查点激酶2的atp竞争性抑制剂，可剂量依赖性地保护人cd4(+)和cd8(+)t细胞免受电离辐射导致的凋亡。最近有研究报导(“chk2 is essential for spindle assembly and dna repairduring the first cleavage of mouse embryos”)，应用25μm的bml-277可严重影响早期胚胎的发育，使得胚胎dna损伤而引发氧化应激。

7、最近有研究报导(“dominant mutations in chk1 cause pronuclear fusionfailure and zygote arrest that can be rescued by chk1 inhibitor”)，编码细胞周期检查点激酶1(checkpoint kinase 1，chk1)的基因突变可导致人类受精卵分裂障碍，突变使得chk1的激酶活性升高，通过磷酸化并抑制下游cdc25c/cdk1通路引起受精卵的细胞周期阻滞；根据该机理，应用合适浓度的chk1抑制剂使突变chk1的激酶活性维持在正常阈值可成功使患者受精卵发育成可移植囊胚。chk1是细胞周期检查点通路中发挥重要作用的蛋白激酶，与dna损伤反应通路共同组成基因组的监控系统。尽管应用chk1抑制剂处理的囊胚基因组倍性完整并具有多能性，抑制chk1治疗卵裂障碍的远期安全性目前无法得知，需要探索更安全有效的胚胎培育方案。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明通过研究，发现egcg、chk2抑制剂以及它们的联合在改善卵成熟、胚胎发育方面具有较大的应用潜能。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、egcg联合chk2抑制剂在制备改善卵成熟或胚胎发育的制剂中的应用。

4、所述卵成熟具体是指哺乳动物的卵母细胞尤其是老年卵(临床上一般指年龄大于37岁的患者卵，实验中常用9月龄以上的小鼠卵作为老年卵模型)的成熟率。

5、所述改善卵成熟具体体现为以下功效之一或若干或全部：提高卵母细胞尤其是老年卵的成熟率，降低卵母细胞死亡与碎片化的比例，降低卵母细胞内的活性氧，改善卵母细胞内的线粒体分布，提升卵母细胞内的线粒体膜电位，改善卵母细胞内的纺锤体形态，降低卵母细胞内异常纺锤体的比例，提高卵母细胞内的atp含量。

6、所述胚胎发育具体是指哺乳动物的受精卵发育到囊胚的能力。

7、所述改善胚胎发育具体体现为：提高受精卵发育至囊胚阶段的成功率。

8、进一步地，所述chk2抑制剂选自bml-277。

9、一种改善卵成熟或胚胎发育的制剂，有效成分为egcg和chk2，其中，egcg的有效浓度为1～100μm，chk2抑制剂的有效浓度为0.01～100nm。优选的，egcg的有效浓度为5～20μm，更优选10μm；chk2抑制剂的有效浓度为5～20nm，更优选10nm。

10、进一步地，所述改善卵成熟或胚胎发育的制剂中还含有基础的胚胎培养基所述基础的胚胎培养基，选自本领域已知的任何合适的哺乳动物胚胎培养基，例如碳酸氢盐缓冲培养基，hepes缓冲或mops缓冲培养基或磷酸缓冲盐水，g1/g1-plus，g2/g2-plus，gmops，ksom，m16，m2，pbs等常用培养基。

11、chk2抑制剂在制备改善卵成熟或胚胎发育的制剂中的应用。

12、进一步地，所述chk2抑制剂选自bml-277。

13、egcg在制备改善卵成熟或胚胎发育的制剂中的应用。

14、本发明通过研究发现，低浓度的chk2抑制剂bml-277可明显提高小鼠老年卵母细胞的发育率，且与适当浓度的egcg联合应用可取得更优的发育结局。这与此前报道的高浓度的(25μm)的bml-277严重影响早期胚胎发育的结果相反，这可能是由于低浓度的bml-277可通过代偿机制，引起其它dna损伤修复通路激活从而促进高龄卵发育。这表明，chk2抑制剂bml-277，以及egcg联合chk2抑制剂，在改善哺乳动物特别是老年哺乳动物的受精能力与妊娠结局方面具有较大的应用潜能。本发明对赋予生殖技术的研究、发展具有重要意义和价值。

15、本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。