一种用于检测SARS-CoV-2病毒N蛋白的纳米抗体及检测卡制备

本发明属于生物检测，涉及一种纳米抗体及所述纳米抗体免疫层析检测卡的制备，用于对sars-cov-2病毒n蛋白的抗原检测。

背景技术：

1、新冠病毒检测可分为新冠病毒的核酸检测、抗原检测和抗体检测。其中新冠病毒核酸检测是最主流的检测手段，实时荧光反转录聚合酶链式反应(rt-pcr)被公认是新冠病毒检测的“金标准”，是目前我国确诊感染新冠病毒最重要的参考指标，核酸检测的优点是灵敏度高，特异性好，可以实现高通量检测和感染早期检测，但对操作者的技术和培训要求较高，对样本保存和安全管理要求较高，对实验仪器和实验环境的要求较高，因此市场对新冠病毒抗原或抗体的检测也有很大需求。对新冠病毒抗原或抗体的检测一般制作成检测卡，检测卡的优点是操作简单便捷，检测结果直观易判，适用于家庭自我检测，也可以用于疑似人群的早期分流和健康管理。

2、新冠病毒的rt-pcr检测首先将新冠病毒提取的病毒基因组rna，反转录成cdna，然后再用设计的特异性引物扩增新冠病毒核酸序列，扩增的过程中荧光染料信号同步变化，研究者可以通过荧光信号的强弱，进行实时检测。核酸检测关键点之一是引物的设计，现在通常以新型冠状病毒orfiab基因和n基因中的保守序列为靶位点设计特异性引物和寡核苷酸荧光探针，该保守序列变异较小，在新冠病毒中普遍存在，对病毒核酸检测特异性高，加上pcr扩增倍数高，因此对痕量的病毒都能检测出来，但新冠病毒从2019年开始到现在已经变异了五代(alpha、beta、gamma、delta和omicron)，rt-pcr检测也存在漏检和错检的风险。随着病毒变化其感染传播更快，但毒性相对下降，人体经疫苗免疫后抵抗力增强，核酸检测ct值在新冠病毒感染上也有了变化，从ct值>40定义为阳性结果，到现在放宽到ct值>35甚至ct值>30才定义为阳性。

3、

4、抗原检测分两种：一种为荧光法，需要配备检测仪器，一般用于隔离点或公共场所检测；另一种为胶体金，类似验孕棒，更适合居家检测。新冠病毒n蛋白又称为核蛋白，是新冠病毒数量最大的抗原，感染后会在人体咽部释放出来，可检测此抗原判断是否感染新冠病毒。n抗原可在临床症状出现前1天就被检测到，因此n蛋白被认为是检测新冠病毒抗原的最佳靶点之一。

5、胶体金免疫层析法使用胶体金试纸进行检测，也就是快速检测试纸。其原理是利用金颗粒的高电子密度特性，以胶体金作为示踪标记物应用于免疫分析，抗体蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面，通过抗原抗体的专一性结合，可以在试纸表面呈现棕红色的检测线，对照质控线可以判断阳性和阴性，从而实现对病毒的检测，其中最关键的是病毒抗体的合成，与待检抗原具有特异性且高亲和力的抗体是胶体金免疫层析法检测最重要的部分。

6、当前市面上的新冠病毒抗原胶体金检测卡，多采用常规抗体制备。常规抗体的耐热性、耐强酸强碱性较差，制备成的检测卡不能长时间存放，且保存条件相对较高。

7、由于纳米抗体基因能够克隆至质粒转化到微生物中表达，可以大规模发酵生产，因此胶体金检测卡制备成本低，生产方便快速。纳米抗体自身稳定性好，较常规抗体耐热和耐强酸强碱，制备成的检测卡存放时间长，常温下方便运输和贮藏。但当前未见适用于新冠病毒检测的高灵敏度的纳米抗体，因此尚不能制备以纳米抗体作为核心的胶体金检测卡。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供以纳米抗体制备的sars-cov-2病毒n蛋白免疫胶体检测卡，解决对新冠病毒抗原的快速、简便、准确检测的问题。

2、本发明解决其技术问题所采用的方案：从制备的新冠病毒n蛋白纳米抗体噬菌体展示库中筛选到对n蛋白有亲和力的纳米抗体，将纳米抗体基因克隆到酵母穿梭质粒，转入酵母细胞发生同源重组，用酵母表达系统表达纳米抗体，从高亲和力的纳米抗体中筛选出一对抗n蛋白的纳米抗体，该配对抗体能同时结合到n蛋白不同抗原表位，将配对抗体分别作为胶体金标记抗体和硝酸纤维素膜上捕获抗体，制备出胶体金免疫检测卡，实现对n蛋白的检测。

3、本发明检测sars-cov-2病毒n蛋白免疫胶体检测卡，包括(1)关键敏感材料是能同时作用于新冠病毒n蛋白不同抗原表位的一对纳米抗体，该配对纳米抗体分别作为检测卡的标记抗体和捕获抗体，纳米抗体3'端保留标签；(2)检测卡主要组件有：包被了金标标记抗体的胶体金结合垫、包被了捕获抗体和抗标签抗体的分析膜、样品垫、吸水垫、底板和塑料模具，(3)检测卡的组装顺序按照在底板的一端依次粘附样品垫、胶体金结合垫，中间黏贴分析膜，另一端粘附吸水垫。

4、第一方面，本发明提供一对用于检测sars-cov-2病毒n蛋白的纳米抗体，所述n蛋白纳米抗体包括标记抗体和捕获抗体；所述标记抗体的互补结合区(cdr)1～3的氨基酸序列分别为vrtfssya，fswsggt，aandkegggyygmdy，如seq id no.1～3所示；所述捕获抗体的互补结合区(cdr)1～3的氨基酸序列分别为ghtfsnya，isrsgsft，aaksalllnsivleflqydy，如seq id no.4～6所示。

5、第二方面，本发明提供一种检测sars-cov-2病毒n蛋白免疫胶体检测卡中的新冠病毒n蛋白纳米抗体的筛选制备方法，具体包括以下步骤：

6、s1：制备新冠病毒n蛋白纳米抗体噬菌体展示库，并从所述展示库中筛选到对n蛋白有亲和力的纳米抗体，经elisa法筛选到的有亲和力的纳米抗体的od值≥0.5；将筛选出的n蛋白纳米抗体基因分别克隆至表达载体中，所述抗体基因3'端设有标签序列；将表达载体转入宿主菌并筛选出单克隆阳性菌落；

7、s2：将单克隆阳性菌落的菌株接种并培养，得到n蛋白纳米抗体并纯化浓缩；

8、s3：对所得n蛋白纳米抗体进行抗体交叉配对，得到能同时与n蛋白不同抗原表位发生免疫结合的一对纳米抗体。

9、优选地，所述步骤s1中的纳米抗体基因克隆具体操作方法为：将筛选出的n蛋白纳米抗体基因克隆到酵母穿梭质粒ppiczalphaa载体，抗体基因位于载体α-factor分泌信号肽之后，抗体基因3'端保留标签序列。

10、进一步地，所述步骤s1中的表达载体转入载体细菌具体操作方法为：将所述载体线性化后转入酵母细胞，经zeocin筛选出单克隆阳性菌落。

11、优选地，所述步骤s2中操作方法为：将单克隆阳性菌落的菌株接种于ypd培养基中，振荡培养至od600＝2.5～3.5时，接种于bmgy培养基中，继续振荡培养至od600＝3.0～5.0，将所得培养菌液离心后用bmmy(用3％质量的甲醇代替bmgy中的甘油)培养基重悬菌体，使菌体浓度od600＝0.8～1.0，并在25～35℃、200～250r/min条件下继续振荡培养；此后，每24h添加1％终体积的甲醇、每24h取发酵液，60～96h后终止诱导培养，对发酵液离心并取上清液进行镍离子亲和层析柱纯化得到纳米抗体蛋白，对纳米抗体蛋白进行超滤脱盐和浓缩，最后将纯化浓缩的纳米抗体重溶于10mm pbs，浓度≥1.0mg/ml。

12、优选地，所述标签为myc标签、6×his标签中的任意一种或两种。

13、第三方面，本发明提供一种检测sars-cov-2病毒n蛋白免疫胶体检测卡，所述检测卡包括样品垫、胶体金结合垫、分析膜、吸水垫和底板，所述胶体金结合垫、分析膜上含有新冠病毒n蛋白纳米抗体，所述新冠病毒n蛋白纳米抗体包括标记抗体和捕获抗体；所述胶体金结合垫上附着有标签标记的新冠病毒n蛋白纳米抗体的标记抗体；所述分析膜上设有检测线(t线)和质控线(c线)，所述检测线上喷划有捕获抗体，所述质控线上喷划有抗标签抗体；所述标记抗体和捕获抗体为第一、第二方面所述病毒n蛋白的纳米抗体。

14、优选地，所述检测sars-cov-2病毒n蛋白免疫胶体检测卡的制备方法包括以下步骤：①将标记抗体和胶体金混合制成金标抗体浸润胶体金垫，捕获抗体和抗标签抗体在分析膜上分别喷划成检测线和质控线；②按照样品垫、胶体金结合垫、分析膜、吸水垫的顺序组装在底板上，组装成试纸条；③将试纸条切割成长条，再将试纸条安装在检测卡外壳中，与模具压合制备成检测卡。

15、优选地，所述分析膜为硝酸纤维素膜(nc膜)。

16、优选地，所述底板为pvc底板。

17、本发明取得的有益效果：(1)纳米抗体基因能够克隆到质粒转化至微生物内表达，可以大规模发酵生产，降低制备成本，生产方便快速；(2)纳米抗体自身稳定性好，较常规抗体耐热和耐强酸强碱，制备成的检测卡存放时间长，常温下方便运输和贮藏。