非共价吸附法包裹蛋白质的DNA病毒示踪剂及其制备方法与应用

本发明属于环境保护领域，具体地说，涉及一种非共价吸附法包裹蛋白质的dna病毒示踪剂及其制备方法与应用。

背景技术：

1、病毒的基本结构包括蛋白质构成的衣壳和包围在衣壳内部受到保护的核酸(dna/rna)。病毒的衣壳蛋白的性质对其运移性质起决定性作用。作为病毒替代物的示踪剂也应该尽量使得表面特性和目标病毒相近，大体上应该满足最外层完全是蛋白质，dna/rna完全包裹在蛋白衣壳内，不可以裸露在外，或穿过蛋白层。

2、现有的dna病毒示踪剂是将sio2纳米球与所选蛋白质和dna共价偶联，蛋白质和dna同时存在于示踪剂的表面，不但与病毒的表面特性相悖，更重要的是，裸露在外的dna没有受到有效保护，使得此示踪剂的半衰期接近于裸链dna在此环境中的半衰期，但远小于目标病毒的半衰期。可能出现由于dna标记被过快分解而导致的假阴性结果。因此，亟需开发一种新型的dna病毒示踪剂。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种非共价吸附法包裹蛋白质的dna病毒示踪剂及其制备方法与应用。

2、针对现有的dna病毒示踪剂存在以下两点不足：(1)裸露在外的dna没有受到有效保护；(2)蛋白质和dna同时存在于示踪剂的表面，这与病毒的表面特性相悖。在接近目标病毒大小的sio2纳米球(直径约70nm的球体)外，使用碳二亚胺交联剂edc(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，将sio2纳米球与所选蛋白质和dna共价偶联(图1a)。

3、本发明构思如下：在sio2内核上先吸附一层dna标记，然后包裹一层sio2外壳，对dna进行有效保护，之后再在最外层通过非共价吸附包裹蛋白质形成衣壳(图1b)。具体来说，先将sio2纳米球(图2a)用tmaps功能化，使其表面带正电(图2b)，然后静电吸附带负电的dna，之后用tmaps中和多余的负电荷并用teos催化sio2生长，以获得一种dna标记的sio2纳米球sio2(dna(sio2))(图2c)。然后采用不同的方法在最外层包裹蛋白质。本发明采用非共价物理吸附法，将sio2(dna(sio2))纳米球分散到缓冲液中，混合后与蛋白质溶液在37℃下温育2小时，离心洗脱三次后，即可获得非共价吸附单层蛋白质的[protein(sio2(dna(sio2)))](图2e)。

4、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种蛋白质包裹的dna病毒示踪剂，由内核、外壳和包裹于外壳的蛋白质衣壳组成；

5、所述内核为表面吸附核酸的sio2纳米球，在内核的外侧包裹一层厚度为y的sio2外壳，在所述外壳的表面通过非共价吸附包裹蛋白质形成厚度为z的衣壳；其中，12nm≤y≤15nm。

6、本发明sio2纳米球的粒径为x，20nm≤x≤120nm，优选x约为40nm。

7、优选地，所述dna病毒示踪剂的粒径为x+2y+2z，60nm≤x+2yb+2z≤160nm，优选示踪剂的粒径约为80nm。可根据所示踪的目标病毒的粒径，通过sio2纳米球的粒径x进行控制，并通过sio2外壳的厚度y和蛋白质衣壳的厚度z微调。

8、本发明中，所述核酸可以是长度60-120bp，且不含茎环、发夹结构的单链或双链dna。

9、所述蛋白质可以是与目标病毒的衣壳蛋白性质接近的蛋白质。例如，选取等电点与目标病毒表面等电点接近的蛋白质，确保表面性质与目标病毒接近。构成衣壳的蛋白可能会有很多种，主要结构蛋白对目标病毒的表面化学性质起关键作用。

10、在本发明的一个具体实施方式中，当目标病毒为腺病毒时，dna病毒示踪剂的最外层可以包裹与腺病毒表面等电点接近的蛋白质，如牛血清白蛋白(bsa)。

11、具体应用时，本发明的dna病毒示踪剂是作为与目标病毒的物理和表面化学性质一致的替代物使用的，根据目标病毒衰亡的速率，需要与噬菌体联合使用，由噬菌体来提供目标病毒的衰亡速率。

12、第二方面，本发明提供一种非共价吸附法包裹蛋白质的dna病毒示踪剂的制备方法，包括以下步骤：

13、(1)将sio2纳米球与功能化试剂tmaps接触，使sio2纳米球的表面带正电，然后静电吸附核酸，作为内核；

14、(2)将所述内核与teos接触，催化sio2生长，在所述内核的外侧形成一层厚度为y的sio2外壳，即sio2(dna(sio2))纳米球，其中，12nm≤y≤15nm；

15、(3)将步骤(2)所得sio2(dna(sio2))纳米球与蛋白质溶液接触，通过非共价吸附，在所述sio2(dna(sio2))纳米球的表面形成厚度为z的蛋白质衣壳。

16、进一步地，所述制备方法包括以下步骤：

17、1)sio2内核胶体溶液的制备：将sio2纳米球悬浮于异丙醇中，制成浓度约为50mg/ml的sio2纳米球胶体溶液；

18、2)表面带正电的tmaps功能化的sio2纳米球的制备：sio2纳米球胶体溶液经超声处理，得到均一的sio2纳米球胶体溶液；向其中加入10μl tmaps溶液，然后在恒温箱中以900rpm的速度在室温下搅拌12小时，用异丙醇洗涤后，得到表面带正电的sio2纳米球；

19、3)静电吸附dna及sio2外壳封装：先用超纯水制备浓度为50μg/ml的核酸溶液；然后向离心管中加入700μl超纯水、320μl核酸溶液和35μl表面带正电的sio2纳米球，混合后超声处理，得到均一的溶液；用超纯水离心洗涤后超声处理，得到均一的胶体溶液；向其中加入0.5μl tmaps溶液，混匀，再加入0.5μl teos，以900rpm的速度在室温下搅拌4小时；然后向体系中再加入4μl teos，在室温下以900rpm的速度搅拌4天；用超纯水洗涤并用超声处理混匀后，得到sio2(dna(sio2))纳米球；

20、4)sio2(dna(sio2))纳米球胶体溶液的制备：将sio2(dna(sio2))纳米球重悬分散在tris缓冲液中，加入150mm nacl，得到浓度为1mg/ml的sio2(dna(sio2))纳米球胶体溶液，用1m hcl调ph值为7.5；

21、5)蛋白质溶液的制备：用tris缓冲液配制蛋白质溶液，加入150mm nacl，得到浓度为2mg/ml的蛋白质溶液；

22、6)非共价吸附蛋白质：将500μl的sio2(dna(sio2))纳米球胶体溶液与500μl的蛋白质溶液混合温育一段时间后，离心，收集纳米球沉淀，用tris缓冲液重悬纳米球，即得蛋白质包裹的dna病毒示踪剂[protein(sio2(dna(sio2)))]。

23、其中，所述tmaps溶液的配制方法如下：将tmaps溶于甲醇，配制成浓度为50％w/w的溶液。

24、所述tris缓冲液的浓度为10mm，ph 7.5。

25、优选地，步骤6)中sio2(dna(sio2))纳米球胶体溶液与蛋白质溶液于37℃温育2小时，然后16000g离心30分钟。

26、步骤3)中用超纯水制备双链dna溶液，所述双链dna是由seq id no:1-4任一所示的单链dna及其反向互补链退火得到的。

27、第三方面，本发明提供按照所述方法制备得到的蛋白质包裹的dna病毒示踪剂。其粒径为(x+2y+2z)，可在60-160nm范围内，根据所示踪的目标病毒的粒径，通过sio2纳米球的粒径x进行控制，并通过sio2外壳的厚度y和蛋白质衣壳的厚度z微调。

28、第四方面，本发明提供所述dna病毒示踪剂在施用有机肥的农业区病原体面源污染时空溯源中的应用；其中，所述病原体包括病毒。

29、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

30、(一)本发明提供的蛋白质包裹的新型dna病毒示踪剂可实现对编码dna的有效保护，便于后续定量检测和分析。

31、(二)有效确保示踪剂最外层衣壳完全由所选蛋白质构成，使得示踪剂的表面特性和运移特性能够更接近目标病毒。