一种靶向5T4的抗体及其应用的制作方法

本发明涉及生物。具体地，涉及一种靶向5t4的抗体及其应用。

背景技术：

1、5t4(也称为滋养层糖蛋白，tpbg或wnt激活的抑制因子1，waif1)，是一种由tpbg基因编码的人类蛋白质。人类tpbg蛋白的分子量约为72kda，包含420个氨基酸，其含有8个富亮氨酸重复序列(lrr)和7个潜在的n-糖基化位点。

2、5t4广泛表达于胚胎发育期的各种滋养层细胞。对于正常成人组织中，5t4只在有限的几种上皮细胞中有表达。但是，5t4在很多癌细胞中表达，如子宫癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、口腔癌、前列腺癌、肺癌或肾癌组织中都检测到5t4的表达，在结肠癌、胃癌或卵巢癌中有证据表明5t4的表达量与癌症的低治愈率相关。肿瘤细胞中5t4的表达通过促进上皮向间质转化(emt)以及抑制经典wnt/beta-连环蛋白信号传导途径和激活非经典wnt途径来促进肿瘤发展。在5t4高表达的肿瘤中，高浓度的cxcl12可以通过cxcr4趋化肿瘤细胞的运动；而在5t4低表达的肿瘤中，低浓度的cxcl12可以提供cxcr7发挥抗凋亡的作用。在非小细胞肺癌、乳腺癌、肾癌或胰腺癌的组织中，5t4的表达高达90％以上。此外，有研究表明在急性髓系淋巴瘤(aml，acute myeloid leukaemia)中，5t4也有广泛的表达。更重要的是，在某些肿瘤干细胞中，5t4也有较高的表达。因此，5t4是一个极具潜力的肿瘤相关抗原，利用包括抗体、肿瘤疫苗、car-t、car-nk等手段靶向5t4，具有非常广阔的应用前景。然而，现有技术中的靶向5t4相关的抗体、car-t、car-nk等的生物性能仍然难以令人满意。

3、因此，本领域亟待开发具有优异性能的新的靶向5t4的抗体。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种靶向5t4的抗体及其应用。

2、在本发明的第一方面，提供了一种靶向5t4的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区包括选自下组的互补决定区cdr：

3、(1)所述重链可变区包括以下互补决定区cdr：

4、seq id no:31所示的hcdr1，

5、seq id no:32所示的hcdr2，和

6、seq id no:33所示的hcdr3；

7、且所述轻链可变区包括以下互补决定区cdr：

8、seq id no:25所示的lcdr1，

9、seq id no:26所示的lcdr2，和

10、seq id no:27所示的lcdr3；或

11、(2)所述重链可变区包括以下互补决定区cdr：

12、seq id no:22所示的hcdr1，

13、seq id no:23所示的hcdr2，和

14、seq id no:24所示的hcdr3；

15、且所述轻链可变区包括以下互补决定区cdr：

16、seq id no:25所示的lcdr1，

17、seq id no:26所示的lcdr2，和

18、seq id no:27所示的lcdr3；或

19、(3)所述重链可变区包括以下互补决定区cdr：

20、seq id no:28所示的hcdr1，

21、seq id no:29所示的hcdr2，和

22、seq id no:30所示的hcdr3；

23、且所述轻链可变区包括以下互补决定区cdr：

24、seq id no:25所示的lcdr1，

25、seq id no:26所示的lcdr2，和

26、seq id no:27所示的lcdr3；或

27、(4)所述重链可变区包括以下互补决定区cdr：

28、seq id no:16所示的hcdr1，

29、seq id no:17所示的hcdr2，和

30、seq id no:18所示的hcdr3；

31、且所述轻链可变区包括以下互补决定区cdr：

32、seq id no:19所示的lcdr1，

33、seq id no:20所示的lcdr2，和

34、seq id no:21所示的lcdr3；其中，所述的cdr序列基于kabat的编号方案。

35、在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区包括选自下组的互补决定区cdr：

36、(1)所述重链可变区包括以下互补决定区cdr：

37、seq id no:40所示的hcdr1，

38、seq id no:41所示的hcdr2，和

39、seq id no:33所示的hcdr3；

40、且所述轻链可变区包括以下互补决定区cdr：

41、seq id no:25所示的lcdr1，

42、seq id no:26所示的lcdr2，和

43、seq id no:27所示的lcdr3；或

44、(2)所述重链可变区包括以下互补决定区cdr：

45、seq id no:36所示的hcdr1，

46、seq id no:37所示的hcdr2，和

47、seq id no:24所示的hcdr3；

48、且所述轻链可变区包括以下互补决定区cdr：

49、seq id no:25所示的lcdr1，

50、seq id no:26所示的lcdr2，和

51、seq id no:27所示的lcdr3；或

52、(3)所述重链可变区包括以下互补决定区cdr：

53、seq id no:38所示的hcdr1，

54、seq id no:39所示的hcdr2，和

55、seq id no:30所示的hcdr3；

56、且所述轻链可变区包括以下互补决定区cdr：

57、seq id no:25所示的lcdr1，

58、seq id no:26所示的lcdr2，和

59、seq id no:27所示的lcdr3；或

60、(4)所述重链可变区包括以下互补决定区cdr：

61、seq id no:34所示的hcdr1，

62、seq id no:35所示的hcdr2，和

63、seq id no:18所示的hcdr3；

64、且所述轻链可变区包括以下互补决定区cdr：

65、seq id no:19所示的lcdr1，

66、seq id no:20所示的lcdr2，和

67、seq id no:21所示的lcdr3；其中，所述的cdr序列基于chothia的编号方案。

68、在另一优选例中，所述的抗体包括重链和轻链，所述的重链包括所述的三个重链cdr以及用于连接重链cdr的重链框架区；所述轻链包括所述的三个轻链cdr以及用于连接轻链cdr的轻链框架区。

69、在另一优选例中，所述抗体的轻链还包括轻链恒定区。

70、在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的，较佳地为人源的。

71、在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。

72、在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的，较佳地为人源的。

73、在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。

74、在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。

75、在另一优选例中，所述的抗体包括单特异性、双特异性、或三特异性抗体。

76、在另一优选例中，所述抗体特异性结合5t4。

77、在另一优选例中，所述抗体对人5t4的亲和力的kd值(m)为1.0e-7～2.0e-9。

78、在另一优选例中，所述抗体具有如seq id no:7所示的重链可变区，和如seq idno:8所示的轻链可变区；或

79、所述抗体具有如seq id no:3所示的重链可变区，和如seq id no:4所示的轻链可变区；或

80、所述抗体具有如seq id no:5所示的重链可变区，和如seq id no:6所示的轻链可变区；或

81、所述抗体具有如seq id no:1所示的重链可变区，和如seq id no:2所示的轻链可变区。

82、在另一优选例中，所述抗体具有的重链可变区与seq id no:7、3、5、1所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性(其中cdr不变或基本不变)。

83、在另一优选例中，所述抗体具有的轻链可变区与seq id no:8、4、6、2所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性(其中cdr不变或基本不变)。

84、在本发明的第二方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

85、(i)如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；

86、以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

87、在另一优选例中，所述的标签序列包括6his标签。

88、在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。

89、在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。

90、在另一优选例中，所述的重组蛋白还包括与所述元件(i)融合在一起的额外的融合元件(或融合多肽片段)。

91、在本发明的第三方面，提供了一种嵌合抗原受体car，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域含有靶向5t4的抗体单链可变区序列scfv，所述scfv的重链可变区和轻链可变区包括选自下组的互补决定区cdr：

92、(1)所述scfv的重链可变区包括以下互补决定区cdr：

93、seq id no:31所示的hcdr1，

94、seq id no:32所示的hcdr2，和

95、seq id no:33所示的hcdr3；

96、且所述scfv的轻链可变区包括以下互补决定区cdr：

97、seq id no:25所示的lcdr1，

98、seq id no:26所示的lcdr2，和

99、seq id no:27所示的lcdr3；或

100、(2)所述scfv的重链可变区包括以下互补决定区cdr：

101、seq id no:22所示的hcdr1，

102、seq id no:23所示的hcdr2，和

103、seq id no:24所示的hcdr3；

104、且所述scfv的轻链可变区包括以下互补决定区cdr：

105、seq id no:25所示的lcdr1，

106、seq id no:26所示的lcdr2，和

107、seq id no:27所示的lcdr3；或

108、(3)所述scfv的重链可变区包括以下互补决定区cdr：

109、seq id no:28所示的hcdr1，

110、seq id no:29所示的hcdr2，和

111、seq id no:30所示的hcdr3；

112、且所述scfv的轻链可变区包括以下互补决定区cdr：

113、seq id no:25所示的lcdr1，

114、seq id no:26所示的lcdr2，和

115、seq id no:27所示的lcdr3；或

116、(4)所述scfv的重链可变区包括以下互补决定区cdr：

117、seq id no:16所示的hcdr1，

118、seq id no:17所示的hcdr2，和

119、seq id no:18所示的hcdr3；

120、且所述scfv的轻链可变区包括以下互补决定区cdr：

121、seq id no:19所示的lcdr1，

122、seq id no:20所示的lcdr2，和

123、seq id no:21所示的lcdr3；

124、其中，所述的cdr序列基于kabat的编号方案。

125、在另一优选例中，所述scfv的重链可变区和轻链可变区包括选自下组的互补决定区cdr：

126、(1)所述scfv的重链可变区包括以下互补决定区cdr：

127、seq id no:40所示的hcdr1，

128、seq id no:41所示的hcdr2，和

129、seq id no:33所示的hcdr3；

130、且所述scfv的轻链可变区包括以下互补决定区cdr：

131、seq id no:25所示的lcdr1，

132、seq id no:26所示的lcdr2，和

133、seq id no:27所示的lcdr3；或

134、(2)所述scfv的重链可变区包括以下互补决定区cdr：

135、seq id no:36所示的hcdr1，

136、seq id no:37所示的hcdr2，和

137、seq id no:24所示的hcdr3；

138、且所述scfv的轻链可变区包括以下互补决定区cdr：

139、seq id no:25所示的lcdr1，

140、seq id no:26所示的lcdr2，和

141、seq id no:27所示的lcdr3；或

142、(3)所述scfv的重链可变区包括以下互补决定区cdr：

143、seq id no:38所示的hcdr1，

144、seq id no:39所示的hcdr2，和

145、seq id no:30所示的hcdr3；

146、且所述scfv的轻链可变区包括以下互补决定区cdr：

147、seq id no:25所示的lcdr1，

148、seq id no:26所示的lcdr2，和

149、seq id no:27所示的lcdr3；或

150、(4)所述scfv的重链可变区包括以下互补决定区cdr：

151、seq id no:34所示的hcdr1，

152、seq id no:35所示的hcdr2，和

153、seq id no:18所示的hcdr3；

154、且所述scfv的轻链可变区包括以下互补决定区cdr：

155、seq id no:19所示的lcdr1，

156、seq id no:20所示的lcdr2，和

157、seq id no:21所示的lcdr3；其中，所述的cdr序列基于chothia的编号方案。

158、在另一优选例中，所述scfv还包含重链可变区和轻链可变区之间的连接肽。

159、在另一优选例中，所述的连接肽为(g4s)3或(g4s)4。

160、在另一优选例中，所述scfv如下式a或式b所示：

161、vh-vl,(a)；vl-vh,(b)

162、式中，vh为所述抗体重链可变区；vl为所述抗体轻链可变区；“-”为连接肽或肽键；

163、并且，vh的氨基酸序列如seq id no:7所示，vl的氨基酸序列如seq id no:8所示；

164、或者，vh的氨基酸序列如seq id no:3所示，vl的氨基酸序列如seq id no:4所示；

165、或者，vh的氨基酸序列如seq id no:5所示，vl的氨基酸序列如seq id no:6所示；

166、或者，vh的氨基酸序列如seq id no:1所示，vl的氨基酸序列如seq id no:2所示。

167、在另一优选例中，所述的抗体单链可变区包括人源的、鼠源的、人鼠嵌合的抗体单链可变区。

168、在另一优选例中，所述scfv如式a(vh-vl)所示。

169、在另一优选例中，所述抗原结合结构域靶向5t4的细胞外区域。

170、在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体具有下式i结构：

171、l-scfv-h-tm-c-cd3ζ(i)

172、式中，

173、各“-”独立地为连接肽或肽键；

174、l为无或信号肽序列；

175、scfv为靶向5t4的scfv；

176、h为任选的铰链区；

177、tm为跨膜结构域；

178、c为共刺激信号分子；

179、cd3ζ为cd3ζ胞浆信号传导序列。

180、在另一优选例中，所述的l为选自下组蛋白的信号肽：cd8、cd4、cd16、cd56、cd137、csf2、dap12、ef1、gm-csf、il-8、il-21或其组合。

181、在另一优选例中，所述的l来源为cd8来源的信号肽。

182、在另一优选例中，所述scfv如下式a或式b所示：

183、vh-vl,(a)；vl-vh,(b)

184、式中，vh为所述抗体重链可变区；vl为所述抗体轻链可变区；“-”为连接肽或肽键。

185、在另一优选例中，所述scfv如式a(vh-vl)所示。

186、在另一优选例中，所述的h为选自下组蛋白的铰链区：cd8、cd28、cd137、fc、或其组合。

187、在另一优选例中，所述的h为cd28来源的铰链区。

188、在另一优选例中，所述的tm为选自下组的蛋白的跨膜区：cd27、cd28、cd3epsilon、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、或其组合。

189、在另一优选例中，所述的tm为cd28来源的跨膜区。

190、在另一优选例中，所述的c为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb(cd137)、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2、或其组合。

191、在另一优选例中，c为cd28来源的共刺激信号分子。

192、在另一优选例中，所述car的氨基酸序列如seq id no:42-45任一所示。

193、在本发明的第四方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，如本发明的第二方面所述的重组蛋白，或如本发明的第三方面所述的嵌合抗原受体car。

194、在另一优选例中，所述多核苷酸为分离的。

195、在本发明的第五方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明的第四方面所述的多核苷酸。

196、在另一优选例中，所述的载体选自下组：dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

197、在另一优选例中，所述载体为逆转录病毒载体。

198、在本发明的第六方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明的第五方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明的第四方面所述的多核苷酸。

199、在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。

200、在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。

201、在另一优选例中，所述细胞为nk细胞或t细胞。

202、在另一优选例中，所述的宿主细胞为工程化的免疫细胞。

203、在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞包括t细胞或nk细胞，较佳地为(i)嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)；或(ii)嵌合抗原受体nk细胞(car-nk细胞)，其中，nk细胞的来源包括外周血、脐带血、胚胎干细胞(esc)、诱导多能干细胞(ipsc)等。

204、在另一优选例中，所述宿主细胞为免疫细胞，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有本发明的第一方面所述的抗体或本发明的第三方面所述的嵌合抗原受体。

205、在另一优选例中，所述的免疫细胞包括nk细胞、t细胞。

206、在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。

207、在本发明的第七方面，提供了一种制备car-nk细胞或car-t细胞的方法，所述的car-nk细胞或car-t细胞表达本发明的第三方面所述的嵌合抗原受体，包括以下步骤：

208、将本发明的第四方面所述的多核苷酸或本发明的第五方面所述的载体转导入nk细胞或t细胞内，从而获得所述car-nk细胞或car-t细胞。

209、在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第三方面所述的嵌合抗原受体、如本发明的第四方面所述的多核苷酸、本发明的第五方面所述的载体、或本发明的第六方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

210、在另一优选例中，所述药物组合物为制剂，优选为液态制剂。

211、在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。

212、在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

213、在本发明的第九方面，提供了一种免疫偶联物，所述的免疫偶联物含有：

214、(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明的第二方面所述的重组蛋白、或其组合；和

215、(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

216、在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如il-2)、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

217、在本发明的第十方面，提供了一种本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第三方面所述的嵌合抗原受体、本发明的第四方面所述的多核苷酸、本发明的第五方面所述的载体、本发明的第六方面所述的宿主细胞、本发明的第八方面所述的药物组合物或本发明的第九方面所述的免疫偶联物的用途，

218、(a)制备检测试剂或试剂盒；和/或

219、(b)制备预防和/或治疗5t4相关疾病的药物或制剂。

220、在另一优选例中，所述5t4相关疾病为癌症或肿瘤。

221、在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

222、在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴白血病(all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、或其组合。

223、在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、或其组合。

224、在另一优选例中，所述的肿瘤为5t4阳性肿瘤；较佳地选自下组：子宫癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、口腔癌、前列腺癌、肺癌、肾癌。

225、在另一优选例中，所述检测为免疫测定法。

226、在另一优选例中，所述免疫测定法是elisa免疫测定法、免疫层析测定法、免疫细胞化学染色测定法或者免疫组化染色测定法。

227、在另一优选例中，所述的诊断试剂为检测片或检测板。

228、在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。

229、在本发明的第十一方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中5t4蛋白的方法，所述方法包括步骤：

230、(1)将样品与本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或本发明的第二方面中的重组蛋白接触；

231、(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在5t4蛋白。

232、在另一优选例中，所述的诊断试剂为检测片或检测板。

233、在另一优选例中，所述方法为细胞免疫化学(immunocytochemistry staning，icc)检测方法，或免疫组化(immunohistochemistryihc)检测方法，或whole cell(全细胞)elisa检测方法，cell lysate(细胞裂解物)elisa检测方法。

234、在本发明的第十二方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包含：

235、(a)在适合表达的条件下，培养本发明的第六方面所述的宿主细胞；

236、(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或本发明的第二方面所述的重组蛋白。

237、在本发明的第十三方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第九方面所述的免疫偶联物、或其组合。

238、在本发明的第十四方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：

239、(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；和/或

240、(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明抗体的二抗；

241、或者，所述试剂盒含有本发明的第一方面3所述的检测板。

242、在本发明的第十五方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第六方面所述的宿主细胞或本发明的第八方面所述的药物组合物。

243、在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

244、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。