一种抗禽流感病毒NP蛋白的纳米抗体及其制备方法与应用

本发明涉及生物，具体涉及一种抗禽流感病毒np蛋白的纳米抗体及其制备方法与应用。

背景技术：

1、在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(vhh)和两个常规的ch2与ch3区，分子量只有15kda，因此也被称作纳米抗(nanobody，nb)。纳米抗体结构简单，抗原特异性好，组织穿透力强，在疾病的诊断及治疗方面具有广阔的应用前景。由于纳米抗体结构的特殊性，故产生了一些独特的性质。首先，纳米抗体是通过对动物外周血中b淋巴细胞的外显子进行pcr扩增得到的一个紧凑的整体结构，通过对其亲和力测定的结果显示，纳米抗体以纳摩尔甚至是皮摩尔的亲和力与抗原相结合，意味着纳米抗体有与单克隆抗体相当的亲和力；其次，纳米抗体具有较高的稳定性，经验证显示，大多数纳米抗体的热稳定强于单克隆抗体和多克隆抗体，同时纳米抗体对有机溶剂耐受度强于单克隆抗体；最后，纳米抗体极易表达，可以在微生物系统、哺乳动物或植物中进行高效表达和批量制备。

2、纳米抗体的开发不同于传统单克隆抗体通过杂交瘤制备的方法，它一般通过免疫羊驼、构建噬菌体文库和通过噬菌体展示来筛选出候选纳米抗体，再通过纳米抗体表达和纯化后与相应抗原进行验证。噬菌体展示技术是一种研究蛋白质与蛋白质或肽之间相互作用的实验技术，主要为了筛选和工程化所需特异性结合的多肽，其原理为噬菌体的衣壳蛋白基因可以和外源蛋白质或者多肽基因片段遗传融合，从而将外源基因的性状在噬菌体表面表达，这些携带不同外源基因的噬菌体组合成一个庞大的合集，即为噬菌体文库。利用噬菌体展示技术可以构建抗体库、随机肽库和cdna文库等。通过简单的分子生物学技术，可以从此庞大的噬菌体文库中筛选出特异性强、亲和力高的纳米抗体。

3、h9n2亚型禽流感病毒可危害鸡的呼吸系统、消化系统、生殖系统，造成肉鸡生长迟缓，蛋鸡产蛋下降，并且还易与其它病原微生物发生混合感染，在免疫压力和抗原漂移作用下，禽流感病毒容易发生抗原变异，最终导致免疫失败，导致症状加重，死亡率显著上升，危害严重。禽流感病毒核蛋白(nuclear protein，np)高度保守，为禽流感分型和鉴定的基础。np蛋白是流感病毒vrnp复合体的关键成分，在病毒复制中发挥重要作用。目前，对于此病的防控关键是以预防和早期诊断为主，当前用于诊断禽流感的主要检测方法是血凝(ha)和血凝抑制(hi)试验，ha试验可用来测定病毒的血凝价，hi试验可用来鉴定血凝素亚型，也可用hi试验检测机体免疫后的抗体水平。该检测方法特异性较好、灵敏度较高，但在实际应用中易受到一些因素的干扰，比如禽类血清中的非特异性因子引起的非特异性反应，导致不能准确测定其抗体水平；由于血凝素的亚型特异性，易出现漏检现象；每次试验前都需要制备红细胞的4单位抗原，这些因素均使得该试验存在一定的缺陷。基于纳米抗体具有分子量小和易于基因工程改造的优点，可以将抗np蛋白纳米抗体与酶等报告基因进行融合表达，从而直接获得纳米抗体与酶的融合蛋白，避免对抗体的标记和使用二抗，从而简化生产工艺，降低生产成本，在流感病毒的诊断制品研究中具有非常广阔的市场前景。

技术实现思路

1、基于此，本发明提供了一种抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的vhh链，该vhh链的氨基酸序列如seq id no：1所示。

2、根据本发明的另一个方面，提供了一种抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体，其是针对禽流感病毒np蛋白抗原表位的纳米抗体，并且具有如seq id no：1所示的氨基酸序列的vhh链。

3、进一步地，该氨基酸序列被选自以下的氨基酸序列所替换：

4、a)该氨基酸序列与seq id no：1所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为95％、96％、97％、98％或至少99％；

5、b)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，该核苷酸序列在严格条件下，与编码seq idno：1所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；

6、c)该氨基酸序列与seq id no：1所示的氨基酸的序列差异不超过5、4、3、2或不超过1个氨基酸；

7、和/或

8、d)该氨基酸序列具有seq id no：1所示的，包括取代、缺失和/或插入1至5个氨基酸残基的氨基酸序列。

9、根据本发明的另一个方面，提供了一种与上述抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的vhh链、或上述抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体相关的生物材料，该生物材料为a1)至a12)中的任一种：a1)编码上述抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的vhh链、或上述抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的核酸分子；

10、a2)含有a1)该核酸分子的表达盒；

11、a3)含有a1)该核酸分子的重组载体；

12、a4)含有a2)该表达盒的重组载体；

13、a5)含有a1)该核酸分子的重组微生物；

14、a6)含有a2)该表达盒的重组微生物；

15、a7)含有a3)该重组载体的重组微生物；

16、a8)含有a4)该重组载体的重组微生物；

17、a9)含有a1)该核酸分子的转基因动物细胞系；

18、a10)含有a2)该表达盒的转基因动物细胞系；

19、a11)含有a3)该重组载体的转基因动物细胞系；

20、a12)含有a4)该重组载体的转基因动物细胞系。

21、进一步地，该核酸分子的核苷酸序列选自：

22、a)该核酸分子的核苷酸序列如seq id no：2所示；

23、b)在严格条件下，与seq id no：2所示的核苷酸杂交的核苷酸序列；

24、c)与seq id no：2所示的核苷酸具有至少大约95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的核苷酸序列；

25、d)编码氨基酸的核苷酸序列，该氨基酸与seq id no：1所示的氨基酸的同一性程度为至少大约95％、96％、97％、98％或至少99％；

26、e)编码氨基酸的核苷酸序列，该氨基酸的序列与seq id no：1的差异不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基；

27、和/或

28、f)编码氨基酸的核苷酸序列，该氨基酸具有seq id no：1所示的，包括取代、缺失和/或插入1至5个氨基酸残基的氨基酸序列。

29、根据本发明的另一个方面，提供了一种产生抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的vhh链或抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的方法，该方法包括以下步骤：

30、(1)将编码上述抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的vhh链、或上述抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的核酸分子导入受体细胞，得到表达该抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的vhh链或该抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的转基因细胞；以及

31、(2)培养该转基因细胞，得到该抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的vhh链或该抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体。

32、进一步地，该禽流感病毒为h1n1亚型、h3n2亚型、h5n6亚型、h6n6亚型、h7n9亚型和/或h9n2亚型禽流感病毒。

33、根据本发明的另一个方面，提供了一种筛选抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的vhh链或抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的方法，该方法包括以下步骤：

34、(1)将灭活后的禽流感病毒进行蔗糖密度梯度离心，将一定量的纯化后的该禽流感病毒与等体积佐剂乳化后，免疫羊驼4～6次，然后采集羊驼外周血，分离外周血淋巴细胞，构建抗禽流感病毒的噬菌体展示文库；以及

35、(2)利用噬菌体展示技术，经过3～5轮筛淘，筛选获得该抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的vhh链或该抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体。

36、进一步地，该禽流感病毒为h1n1亚型、h3n2亚型、h5n6亚型、h6n6亚型、h7n9亚型和/或h9n2亚型禽流感病毒。

37、根据本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含(a)权利要求1或3该的抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的vhh链、或权利要求2或3该的抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体；以及(b)药学上可接受的载体。

38、根据本发明的另一个方面，提供了一种重组蛋白，该重组蛋白包含(a)权利要求1或3该的抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的vhh链的序列、或权利要求2或3该的抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的序列；以及(b)协助表达和/或纯化的标签序列。

39、进一步地，该标签序列包括6his标签和/或ha标签。

40、根据本发明的另一个方面，提供了一种权利要求1或3该的抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的vhh链、或权利要求2或3该的抗禽流感病毒np蛋白纳米抗体的用途，用于制备(a)用于检测抗禽流感病毒np蛋白分子的药剂、试剂、检测板或试剂盒；或者(b)用于制备预防和/或治疗禽流感病毒感染的药物；或者(c)用于区分禽流感病毒和新城疫病毒；

41、进一步地，该禽流感病毒为h1n1亚型、h3n2亚型、h5n6亚型、h6n6亚型、h7n9亚型和/或h9n2亚型禽流感病毒。

42、本发明的有益效果：

43、本发明公开了一种抗禽流感病毒np蛋白的纳米抗体制备方法和应用，该纳米抗体的vhh链的氨基酸序列如seq id no:1所示，其核苷酸序列如seq id no:2所示。本发明通过蔗糖密度梯度离心超离纯化灭活的h9n2亚型禽流感病毒，将其作为免疫原免疫羊驼，构建噬菌体展示文库，通过phage-elisa方法筛选获得了1株高亲和力、广谱型的抗禽流感病毒np蛋白的纳米抗体，该纳米抗体能够良好结合不同亚型禽流感病毒np蛋白。