基于小豆全基因组测序和核心种质重测序开发的SSR核心引物组及其应用

本发明属于分子生物学，具体涉及基于小豆全基因组测序和核心种质重测序开发的ssr核心引物组及其应用。

背景技术：

1、小豆(vigna angularis)，属豆科(leguminosae)菜豆族(phaseoleae)豇豆属(vigna l.)，别名红豆，红小豆，赤豆，古名赤菽、小菽等。小豆起源于中国，栽培历史悠久，已有2000多年的栽培历史，是中国的六大食用豆类之一。小豆是我国传统的特色栽培作物，是我国现代农业种植结构调整的重要作物之一，中国是世界上小豆种植面积和产量最大的国家。小豆富含蛋白质、维生素、矿质元素等营养物质，因此被广泛应用于制作豆包、甜点、豆饭、冰淇淋和豆奶等食品，在亚洲血统人群的食物消费组成及国际食用豆类贸易中占有重要地位。小豆为医食同源作物，具有祛湿、解毒和降血糖等药用价值和减肥消脂保健功能。小豆是二倍体物种(2n＝22)，基因组仅539mb，生育期较短，是理想的豆科作物遗传研究的物种。此外，小豆耐瘠，耐阴，适应性广，固氮养地能力强，宜与禾本科作物间作套种、轮作换茬。鉴于此，加强小豆遗传育种的研究，开展小豆品种鉴定、指纹图谱构建、遗传多样性研究均有重要的现实意义。

2、分子标记是指可遗传的并可检测的反映个体或种群间基因组中某种差异的特异性dna片段，也叫dna标记。分子标记广泛分布于真核生物的基因组中。简单重复序列(simple sequence repeats，ssr)也称微卫星(microsatellite)，是指1-6个核苷酸为单位在基因组中多次串联重复的dna序列，长度一般在200bp以下。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了ssr长度的高度变异性，由此而产生ssr标记。虽然ssr在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用微卫星区域设计成对引物，通过pcr技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示ssr位点在不同个体间的多态性。ssr标记技术具备以下优点：(1)标记数量多，高多态性，信息量大；(2)没有组织特异性，与生长发育程度无关，取材不受发育和季节性限制；(3)能明确辨别等位基因；(4)标记均匀分布于整个基因组；(5)选择中性，不影响目标性状的表达；(6)检测手段简单、快速；(7)成本低廉；(8)稳定，重复性好；(9)共显性遗传。目前该技术被广泛应用于植物遗传多样性研究、品种鉴定、遗传图谱构建、分子标记辅助选择、qtl定位、比较基因组研究等领域。与小麦、水稻、玉米等作物相比，现有小豆ssr标记数量很少，仍存在多态性低，基因组覆盖率低等问题，不能满足小豆研究的需求，大量开发覆盖全基因组的ssr标记仍然是目前小豆育种研究的工作内容，具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供一种基于小豆全基因组测序和核心种质重测序开发的ssr核心引物组及其应用。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为了实现上述目的，本发明首先提供了基于小豆全基因组序列开发的ssr核心引物组，所述ssr核心引物组包括230对引物中的至少5对，所述230对引物的核苷酸序列如seqid no.1-seq id no.460所示。

3、进一步地，所述至少5对可为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210或220对。

4、进一步地，针对小豆1号染色体vac1的引物的核苷酸序列如seq id no.1-seq idno.50所示；针对小豆2号染色体vac2的引物的核苷酸序列如seq id no.51-seq id no.98所示；针对小豆3号染色体vac3的引物的核苷酸序列如seq id no.99-seq id no.156所示；针对小豆4号染色体vac4的引物的核苷酸序列如seq id no.157-seq id no.198所示；针对小豆5号染色体vac5的引物的核苷酸序列如seq id no.199-seq id no.240所示；针对小豆6号染色体vac6的引物的核苷酸序列如seq id no.241-seq id no.268所示；针对小豆7号染色体vac7的引物的核苷酸序列如seq id no.269-seq id no.314所示；针对小豆8号染色体vac8的引物的核苷酸序列如seq id no.315-seq id no.352所示；针对小豆9号染色体vac9的引物的核苷酸序列如seq id no.353-seq id no.382所示；针对小豆10号染色体vac10的引物的核苷酸序列如seq id no.383-seq id no.434所示；针对小豆11号染色体vac11的引物的核苷酸序列如seq id no.435-seq id no.460所示。

5、进一步地，所述ssr核心引物组是基于小豆全基因组测序和核心种质重测序序列开发的。

6、本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒可包含所述ssr核心引物组。

7、本发明还提供了dna芯片，所述dna芯片可包含所述ssr核心引物组。

8、本发明还提供了所述ssr核心引物组，和/或，所述试剂盒，和/或，所述dna芯片的下述任一种应用：

9、a1)在小豆遗传多样性分析中的应用；

10、a2)在小豆品种多样性分析中的应用；

11、a3)在小豆亲缘关系分析中的应用；

12、a4)在小豆品种鉴定中的应用；

13、a5)在构建小豆遗传图谱或dna指纹图谱中的应用；

14、a6)在小豆种质资源改良中的应用；

15、a7)在小豆基因定位或功能基因挖掘中的应用；

16、a8)在小豆分子标记辅助育种中的应用。

17、进一步地，所述a1)可为在野生小豆、小豆和小豆近源种遗传多样性分析中的应用。

18、进一步地，所述a4)可为在栽培小豆和小豆近源种品种多样性分析中的应用。

19、本发明还提供了所述ssr核心引物组的筛选方法，所述方法可包括如下步骤：

20、b1)对小豆种质资源材料进行基因组重测序；

21、b2)以小豆京农6号全基因组序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/gcf_001190045.1，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/gca_001723775.1)为参考基因组，对参考基因组ssr位点进行全基因组扫描，获得ssr标记；

22、b3)对所述ssr标记进行种质资源材料间多样性的筛选；

23、b4)对b3)筛选出的ssr标记进行引物设计，得到所述ssr核心引物组。

24、上述方法中，b3)中所述筛选标准可为：小豆核心种质材料间的多样性比例为25％以上，二核苷酸的重复次数≥11，去除基因组中冗余ssr位点。

25、上述方法中，b4)中所述引物设计的参数可包括：引物退火温度60-65℃，引物长度22-25bp，引物位于ssr位点侧翼距ssr位点有45-150bp以保障引物特异性，扩增产物长度在80-300bp。

26、b1)中所述小豆种质资源材料可为能代表小豆全部种质资源遗传多样性的小豆核心种质材料。

27、进一步地，b1)中所述小豆种质资源材料可为表1中的322份小豆核心种质材料。

28、进一步地，所述b2)还包括对获得的ssr标记和侧翼序列进行筛选，去除重复序列的步骤，去除重复序列后得到京农6号小豆基因组非重复ssr标记。

29、b3)中所述ssr标记可为所述京农6号小豆基因组非重复ssr标记。

30、进一步地，所述b3)可为以步骤b2)获得的京农6号小豆基因组非重复ssr标记为参考序列，筛选小豆核心种质材料间存在多态性的位点。

31、在本发明的一个实施方案中，所述b3)可包括如下步骤：

32、(1)以获得的京农6号小豆基因组非重复ssr标记为参考序列，筛选小豆核心种质材料间存在多态性的位点，筛选标准为：在322份小豆核心种质材料间的多样性比例为25％以上。

33、(2)对步骤(1)获得的ssr标记位点，利用ssr hunter软件搜索ssr序列，搜索ssr序列的标准为：二核苷酸的重复次数≥11，去除基因组中冗余ssr位点。

34、(3)对搜索到的ssr序列进行ssr位点筛选，筛选标准为：基因组中每500k-1000k物理距离范围内开发一个ssr标记。

35、本发明还提供了一种利用所述ssr核心引物组进行小豆遗传多样性分析或亲缘关系分析的方法，所述方法可包括：以待测小豆基因组dna为模板，利用所述ssr核心引物组进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，对所述pcr扩增产物进行电泳检测，根据电泳检测结果进行小豆遗传多样性分析或亲缘关系分析。

36、进一步地，所述根据电泳检测结果进行小豆遗传多样性分析或亲缘关系分析包括统计所述电泳检测结果，同一电泳迁移率位置若有条带记录为“1”，若无条带记录为“0”。进一步进行聚类分析，构建亲缘关系树状图，根据统计结果进行小豆遗传多样性分析或亲缘关系分析。

37、进一步地，所述进行聚类分析可使用ntsys-pc ver.2.10e软件进行基于upgma法的聚类分析。

38、本发明还提供了一种利用所述ssr核心引物组对小豆品种进行指纹图谱分析以鉴定小豆品种的方法，所述方法可包括：分别以待测小豆和标准小豆品种基因组dna为模板，利用所述ssr核心引物组进行pcr扩增，pcr扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得待测小豆指纹图谱与标准小豆品种指纹图谱，根据指纹图谱比对分析结果进行小豆品种的鉴定。

39、上述方法中，所述pcr扩增的反应体系可为15μl，包含上游引物0.1μmol/l，下游引物0.1μmol/l，dntps 1mmol/l，mg2+1.5mmol/l，taq聚合酶1u，小豆基因组dna 50ng；pcr扩增程序可为：94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。

40、进一步地，上述方法中，所述电泳检测可为对所述pcr扩增产物采用7％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

41、进一步地，所述电泳检测包括步骤：上样1μl pcr产物，以100bp ladder dnamarker为分子量标准，60w恒压电泳1小时，银染显影。

42、本文所述待测小豆可为野生小豆、小豆农家种、小豆地方品种、小豆商业品种或育成小豆。

43、进一步地，小豆品种鉴定方法可为将小豆品种标准样和供试样品dna，使用核心引物(每条染色体vac1-vac11随机选取2对)进行pcr指纹图谱的鉴定，当标准样和供试样指纹图谱不一致时供试样品与小豆品种标准样品为不同品种。

44、本发明基于小豆全基因组测序和核心种质重测序开发了ssr标记及其核心引物组。ssr核心引物组包括230对引物中的至少5对，230对引物的核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.460所示(表2)。本发明建立了小豆全基因组ssr标记位点的筛选(开发)方法，该方法具有全面、完整、准确可靠的优点，解决了现有小豆ssr标记数量少、多态性低、基因组覆盖率低等问题。本发明根据ssr标记进行引物设计、pcr扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并将ssr标记应用在栽培小豆亲缘关系鉴定。实验表明，本发明公开的引物组合能够最大限度的反映小豆种质资源材料的遗传多样性，具有多态性高、分布均匀、扩增稳定、重复性好、位点明确、电泳条带清晰易于辨别、便于统计的特点，能覆盖整个基因组，有着重要的实用价值。本发明的引物组合能应用于野生小豆、栽培小豆、小豆农家种、育成小豆以及小豆近缘种，能最大限度的准确进行亲缘关系分析和多样性分析，并且有助于准确、快速的进行遗传图谱构建、基因定位、品种鉴定和品种dna指纹图谱构建等研究，为小豆的分子标记辅助育种奠定基础，具有广泛的应用前景。