一种低成本生物基乙醇酸的发酵及其分离纯化技术

本发明涉及一种低成本生物基乙醇酸的发酵及其分离纯化技术，属于微生物培养。

背景技术：

1、大肠杆菌(escherichia coli)作为一种生化代谢非常活跃的常见的工程菌株，通过对其进行代谢工程改造可以生产多种代谢物，其中，乙醇酸(glycolic acid)作为大肠杆菌能够产生的一种羟基酸，是α-羟基酸家族中最小的一员。乙醇酸在分子结构上同时具有醇羟基和梭基，所以其结构特征使得乙醇酸具有高酸度和保湿的双重功能并广泛应用于多种化学工艺，如化妆品及化学清洗等领域，并作为生物聚合物的前体在医药行业及环保行业具有广阔的应用前景。

2、目前乙醇酸的生产方法主要有化学法和生物法。而生物法中的全生物法合成乙醇酸作为一种对环境友好的温和可持续的合成方法，近年来引起了越来越多的关注。全生物法合成乙醇酸目前产量最高的两篇报道所用培养基分别为m9发酵培养基(6.78g·l-1磷酸氢二钠，3g·l-1磷酸二氢钾，1g·l-1氯化铵，0.5g·l-1氯化钠，10g·l-1葡萄糖，0.24g·l-1硫酸镁，0.115g·l-1氯化钙，8g·l-1胰蛋白胨，2g·l-1酵母粉，8g.l-1葡萄糖)，am1矿物盐培养基(28g·l-1葡萄糖、5.2g·l-1醋酸钠，2g·l-1酵母提取物)。上述培养基中含有的高昂氮源与碳源严重限制了生物基乙醇酸的规模化生产，因此降低发酵培养基的成本，优化培养基成分以提高微生物发酵产量是全生物法合成乙醇酸工业化的重要步骤，为了达到上述目的，亟需设计一种大肠杆菌高产乙醇酸的低廉培养基。

3、玉米浆(csl)和玉米芯水解液(cch)是玉米加工过程中产生的低廉生物质副产品。玉米浆中富含氨基酸、蛋白质和微量元素，以及各种生物素、维生素b1和一些前体，可以为生物发酵提供足够的氮源和营养因子。玉米芯水解液的主要成分是纤维素(33-35％)和半纤维素(38-40％)，是全球公认的重要可再生生物资源，其酶解产物中含有大量的葡萄糖和木糖，可作为一种廉价、高效的碳源。玉米芯水解液常常用于制高价值木糖，提取完木糖后的玉米芯水解液其成本单价进一步降低。此外，生物基乙醇酸发酵液的下游分离纯化技术的报道非常匮乏，这同样限制了乙醇酸的工业化生产应用。为了尝试解决上述问题，本研究采用一株生产乙醇酸的mgly6-h1菌株，通过统计学方法获得了最优培养配方工艺，并采用沉淀法初步构建了下游生物分离纯化体系。

技术实现思路

1、本发明利用一株产乙醇酸工程菌株mgly6-h1，优化大肠杆菌发酵生产乙醇酸的过程，大大的提高了乙醇酸的产量，同时降低了培养基的成本，在此基础上开展下游分离纯化，获得了高纯度的生物基乙醇酸产品。

2、本发明提供了一种促进菌株高产乙醇酸的培养基，所述培养基由玉米芯水解液，nh3·h2o，玉米浆，cacl2，mgso4·7h2o，kh2po4，nacl，na2hpo4和金属离子溶液组成。

3、在一种实施方式中，所述金属离子溶液包括cu2+、mn 2+、fe 2+或zn 2+。

4、在一种实施方式中，所述金属离子溶液为zncl2和mncl2·4h2o。

5、在一种实施方式中，所述培养基由5～10g·l-1玉米芯水解液，1～2g·l-1nh3·h2o，10～15g·l-1玉米浆，4～10mg·l-1cacl2，1～5mg·l-1mgso4·7h2o，3～6g·l-1kh2po4，0.5g·l-1nacl，20～30g·l-1na2hpo4，0.1～0.15mg·l-1zncl2和0.03～0.04mg·l-1mncl2·4h2o组成。

6、在一种实施方式中，所述培养基由6.66mg·l-1cacl2，3mg·l-1mgso4·7h2o，0.13mg·l-1zncl2，0.0396mg·l-1mncl2·4h2o，4.5g·l-1kh2po4，8.4g·l-1玉米芯水解液，1.18g·l-1nh3·h2o，13.79g·l-1玉米浆，0.5g·l-1nacl和25.43g·l-1na2hpo4组成。

7、本发明还提供了所述培养基在化学、材料、医药领域中的应用。

8、本发明还提供了所述培养基在生产乙醇酸中的应用。

9、在一种实施方式中，所述应用为乙醇酸生产菌株接种于所述培养基中发酵生产乙醇酸。

10、在一种实施方式中，所述乙醇酸生产菌株为菌株mgly6-h1。

11、在一种实施方式中，将乙醇酸生产菌株的种子液接种于所述培养基中，在35～38℃条件下培养15～30h。

12、本发明提供了一种制备高纯度生物基乙醇酸的方法，所述方法步骤如下：

13、(1)将乙醇酸生产菌株接种于上述培养基中发酵制备含有乙醇酸的发酵液，离心收集上清，得发酵上清液；

14、(2)向发酵上清液中加入活性炭进行脱色，得脱色液；

15、(3)在获得的脱色液中加入氨水反应，得碱性反应液；

16、(4)向碱性反应液中加入氢氧化钙反应，离心，得沉淀，

17、(5)取沉淀加入硫酸进行酸化，得酸化液；

18、(6)在酸化液中加入无水异丙醇，搅拌后抽滤，得滤液；

19、(7)将滤液进行常压脱醇，高真空回收醇，得料液；

20、(8)将料液降温析晶并恒温抽滤，得乙醇酸湿品；

21、(9)低温高真空条件处理乙醇酸湿品，得固体乙醇酸。

22、在一种实施方式中，步骤(1)中，所述乙醇酸生产菌株为菌株mgly6-h1。

23、在一种实施方式中，步骤(1)中，将乙醇酸生产菌株的种子液接种于上述培养基中，在35～38℃条件下培养15～30h。

24、在一种实施方式中，步骤(2)中，活性炭添加量为1～11g/100ml，温度为40～60℃，搅拌时间为0.5～2h。

25、在一种实施方式中，步骤(3)中，加入脱色液体积的5～10％的氨水，搅拌反应1.～3h。

26、在一种实施方式中，步骤(4)中，氢氧化钙在碱性反应液的质量百分比浓度为25～35％，反应温度30～50℃，时间为4～7h。

27、在一种实施方式中，步骤(5)中，硫酸的终浓度为1.5～2mol/l，50～60℃搅拌1～3h。

28、在一种实施方式中，步骤(6)中，无水异丙醇加入量为溶液中乙醇酸质量的2～6倍。

29、在一种实施方式中，步骤(7)中，在2－8kpa、40～75℃条件下回收醇。

30、在一种实施方式中，步骤(8)中，以1℃/min条件进行降温析晶，当温度降到0～20℃时停止降温并恒温保持0.8～1.2h。

31、本发明还提供了所述方法在生产乙醇酸或含有乙醇酸产品中的应用。

32、有益效果

33、(1)本发明以mgly6-h1菌株为工程菌株，首先对培养基中碳源和氮源进行优化，并且添加了各种有利于菌株生产乙醇酸的金属离子，取得了较好的优化结果。于原有的发酵培养基相比，利用改良发酵培养基进行发酵生产，在相同发酵时间内乙醇酸产量提高明显，发酵液中的乙醇酸含量可以达到8.44g/l，实现了产量的飞跃式突破。本发明有效利用了提取过木糖后的玉米浆水解液，实现了工业废弃物的再利用，并且成本低廉，单位乙醇酸成本为4562元/吨。本发明在降低成本的同时显著提高了乙醇酸的产量，实现了高值转化。

34、(2)在此基础上进一步探索生物基乙醇酸的分离提纯方法，回收率达54.1％，乙醇酸样品纯度达到99.3％，为全生物法生产乙醇酸工业化奠定了基础，在工业上具有潜在而广泛的应用价值。