鉴定玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性的InDel分子标记及其应用

本发明属于分子遗传学，具体涉及一种鉴定玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性的indel分子标记及其应用。

背景技术：

1、玉米是我国种植面积最大并且产量最高的粮食作物，在国家粮食安全中发挥重要作用。玉米种子内部拟轮枝镰孢菌感染现象非常普遍，在储存过程中极易发生霉变，大大缩短储存期，而且种子内部不断积累的真菌毒素严重威胁人畜健康安全。如果无症状感染的籽粒作为次年生产用种子，就会成为新的初侵染源，导致新一轮的茎腐病、穗粒腐病等主要病害发生，造成严重减产。玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性不同于常规的种子抗性，育种家培育的抗病品种往往在种内抗性表型上较差，究其原因在于抗病亲本种质资源的筛选以及对种内病原真菌抗性遗传机制了解的匮乏。由于鉴定玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性表型较为繁琐、参与玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性的优异基因资源，及其相关的功能等位变异匮乏，造成优异种质资源稀缺，严重限制了相关分子育种工作的进展。

2、插入-缺失标记(insertion-deletion，indel)是指同一物种中不同个体，对玉米来说是自然分化群体中的不同株系，基因组相同位点的dna序列发生核苷酸片段的插入或缺失，在同源比对的时候，一些个体产生空位的现象。在玉米自然分化群体中，indel变异分布十分广泛、数量众多。indel多态性分子标记是基于插入、缺失位点两侧或插入缺失片段本身设计的能够区分同一性状在不同个体间的表现型的pcr扩增标记，能够便捷的利用电泳平台进行基因型分型，或预测其相关联性状的表型，在玉米分子辅助育种中发挥重要作用。indel分子标记准确性高、稳定性好，且检测便捷，被广泛应用于作物分子辅助遗传育种和基因组关联分析中。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种鉴定玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性的indel分子标记及其应用。本发明利用全基因关联分析，精准地检测到与玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性性状显著关联的grmzm2g083526基因位点。进一步通过启动子测序，明确：在自然分化群体中，grmzm2g083526基因启动子上存在两个完全连锁的indel等位变异，与grmzm2g083526基因转录表达相关，从而控制不同玉米株系对拟轮枝镰孢菌抗性差异。利用上述indel变异位点作为遗传标记，可应用于种内拟轮枝镰孢菌抗性优异的种质资源筛选，加速相关育种进程，具有较高的应用价值。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种鉴定玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性的indel分子标记，其特征在于，所述玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性性状基因位于玉米5号染色体上grmzm2g083526基因启动子区域，包括两个紧密连锁的indel分子标记分别为indel-329和indel-395，均有插入和缺失两种纯和基因型；

3、所述玉米5号染色体上grmzm2g083526基因启动子在b73参考基因组的核苷酸序列如seq id no.5所示；

4、所述indel-329分子标记由7个核苷酸组成，位于b73参考基因组chr5_90341531bp位置；所述indel-329分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，在玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性较弱时为插入基因型，在玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性较强时为缺失基因型；

5、所述indel-395分子标记由7个核苷酸组成，位于b73参考基因组chr5_90341465bp位置；indel-395分子标记的核苷酸序列如seq id no.2所示，在玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性较弱时为插入基因型，在玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性较强时为缺失基因型；

6、所述indel分子标记的引物对由正向引物和反向引物组成，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.3中所示；所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；

7、该引物对位于所述indel分子标记两端500bp以内侧翼序列，包括横跨indel分子标记的区段或与indel分子标记匹配的单链dna。

8、本发明还提供了一种鉴定玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性的indel分子标记的检测方法，其特征在于，该方法为：

9、提取玉米基因组dna，用所述的引物对对提取的玉米基因组dna进行pcr扩增，得到pcr产物；

10、所述pcr扩增的反应体系为：kod fx neo mix 10μl、正向引物(10μmol/l)1μl、反向引物(10μmol/l)1μl、玉米基因组dna 1μl、ddh2o 7μl；

11、所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.3中所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；

12、所述pcr扩增的反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸10s，共35个循环；68℃再延伸10min；

13、所述测定pcr产物中indel分子标记的方法是：pcr扩增后，将扩增产物进行琼脂糖电泳分离，将特异性引物回收纯化，进行一代dna测序，利用dnaman进行序列比对；在grmzm2g083526启动子上物理位置chr5_90341531bp处为seq id no.1所示的七碱基插入基因型，同时物理位置chr5_90341465bp处为seq id no.2所示的七碱基插入基因型的，鉴定为种内拟轮枝镰孢菌感性材料；在grmzm2g083526启动子上物理位置chr5_90341531bp处为seq id no.1所示的七碱基缺失基因型，同时物理位置chr5_90341465bp处为seq id no.2所示的七碱基缺失基因型的，鉴定为种内拟轮枝镰孢菌抗性材料。

14、本发明还提供了鉴定玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性的indel分子标记的应用，其特征在于，所述鉴定玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性的indel分子标记可应用于玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性性状检测试剂盒、玉米种质资源分析或玉米辅助遗传育种。

15、本发明的玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性相关indel分子标记准确稳定、无需酶切等冗杂步骤；所述的indel分子标记多态性在基因组dna水平上进行，在玉米不同发育时期、不同组织器官中均可进行检测，尤其在苗期进行鉴定，能够有效加快玉米选育进程。

16、本发明所述indel分子标记引物对和试剂盒，扩增产物稳定，特异性强，灵敏度高。

17、本发明与现有技术相比具有以下优点：

18、1、本发明利用全基因关联分析，精准地检测到与玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性性状显著关联的grmzm2g083526基因位点。进一步通过启动子测序，明确：在自然分化群体中，grmzm2g083526基因启动子上存在两个完全连锁的indel等位变异，与grmzm2g083526基因转录表达相关，从而控制不同玉米株系对拟轮枝镰孢菌抗性的差异。利用上述indel变异位点作为遗传标记，可应用于种内拟轮枝镰孢菌抗性性状的鉴定，筛选抗性优异的种质资源。

19、2、本发明的玉米种内拟轮枝镰孢菌抗性相关indel分子标记准确稳定、无需酶切等冗杂步骤；本发明所述的indel分子标记多态性在基因组dna水平上进行，在玉米不同发育时期、不同组织器官中均可进行检测，尤其在苗期进行鉴定，能够有效加快玉米选育进程。

20、3、本发明所述indel分子标记引物对和试剂盒，扩增产物稳定，特异性强，灵敏度高，可广泛应用于玉米种质资源分析和分子辅助遗传育种，具有较高的应用价值。

21、下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。