骨形态发生蛋白BMP-4的表达及纯化工艺的制作方法

本发明专利涉及一种骨形态发生蛋白bmp-4的表达及纯化工艺，属于生物。

背景技术：

1、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，bmps)属于转化生长因子-β(transforming growth factor-β，tgf-β)超家族的成员，是1965年由urist等人首先从脱钙骨基质提取物中分离得到的一种有活性的蛋白质。骨形态发生蛋白广泛存在于骨基质中，是一种酸性多肽，具有诱导成骨和成软骨的作用，并且在其他多种器官的分化发育过程中发挥重要作用。

2、骨形态发生蛋白4(bmp-4)是骨形态发生蛋白家族中的一员。人类bmp-4有两种，一种是在成熟胎盘组织中表达的，包括402个氨基酸，另外一种是骨肉瘤表达的，具有408个氨基酸，两者的活性片段均由羧基末端的116个氨基酸构成(ser293-arg408)。bmp-4具有7个半胱氨酸(cys)残基，有6个形成分子内二硫键，另一个cys形成分子间二硫键以此连接两条多肽链形成二聚体结构。bmp-4大多是同源二聚体，并且以二聚体的形式发挥活性。bmp-4不仅可以促进软骨和骨组织形成，而且可以调节细胞凋亡和细胞信号传导。另外，bmp-4还与细胞增殖密切相关，对细胞分化和器官发生、发育具有重要的意义，是胚胎发育中必不可少的信号分子。研究发现，bmp-4的生物学作用几乎涉及全身的所有系统，包括心血管系统、胃肠系统、呼吸系统、神经系统及胚胎发育、生长和分化。

3、人们通过重组技术生产bmp-4，以便研究其信号传导过程以及潜在的治疗价值。目前，商业化的重组人bmp-4蛋白主要来源于ns0和hek293细胞系，另外，cho细胞也被用于生产。哺乳动物细胞系用于生产的主要缺点是成本高和产量低。另外，也有报道用巴斯德毕赤酵母系统表达优化过密码子的重组人骨形态发生蛋白4，成功分泌出蛋白，但是展现出高糖基化的特点，并且分泌的是单体，在向成熟结构折叠时存在一定的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种骨形态发生蛋白bmp-4的表达及纯化工艺，可用原核系统进行表达。

2、本发明采取的技术方案为：

3、一种骨形态发生蛋白bmp-4的表达及纯化工艺，其步骤包括：

4、(1)包涵体的表达：构建并培养带有his标签的骨形态发生蛋白bmp-4的基因工程菌，诱导目的蛋白的表达，其中骨形态发生蛋白bmp-4的氨基酸序列如seq id no.2所示；

5、(2)包涵体的收集：去上清，收集菌体，破碎菌体，离心收集沉淀；

6、(3)包涵体的洗涤：用洗涤溶液洗涤步骤(2)收集的沉淀，获得洗涤后的包涵体；

7、(4)包涵体的变性：用变性溶液溶解洗涤后的包涵体，过滤，除去沉淀，收集滤液；

8、(5)包涵体的复性：在滤液中加入稀释溶液进行包涵体的复性，将复性液透析至透析溶液中；

9、(6)ni柱亲和纯化，获得正确折叠的bmp-4蛋白。

10、优选的，所述洗涤溶液洗涤具体为：依次加入洗涤溶液1、洗涤溶液2、洗涤溶液3、洗涤溶液4、洗涤溶液5进行洗涤；

11、其中所述洗涤溶液1的配比包括10-30mm tris，50-150mm nacl，0.8-1.2m urea，ph7.5-8.5；

12、其中所述洗涤溶液2的配比包括10-30mm tris，50-150mm nacl，1.6-2.4m urea，ph7.5-8.5；

13、其中所述洗涤溶液3的配比包括10-30mm tris，50-150mm nacl，2.5-3.5m urea，ph7.5-8.5；

14、其中所述洗涤溶液4的配比包括10-30mm tris，50-150mm nacl，1.6-2.4m urea，ph7.5-8.5；

15、其中所述洗涤溶液5的配比包括10-30mm tris，50-150mm nacl，ph7.5-8.5。更优选的，其中所述洗涤溶液1的配比包括20mm tris，100mm nacl，1m urea，ph8.0；

16、其中所述洗涤溶液2的配比包括20mm tris，100mm nacl，2m urea，ph8.0；

17、其中所述洗涤溶液3的配比包括20mm tris，100mm nacl，3m urea，ph8.0；

18、其中所述洗涤溶液4的配比包括20mm tris，100mm nacl，2m urea，ph8.0；

19、其中所述洗涤溶液5的配比包括20mm tris，100mm nacl，ph8.0。

20、优选的，所述洗涤溶液洗涤更具体的为：加入洗涤溶液1，6000-10000rpm，离心8-12min；

21、加入洗涤溶液2，6000-10000rpm，离心8-12min；

22、加入洗涤溶液3，6000-10000rpm，离心8-12min；

23、加入洗涤溶液4，6000-10000rpm，离心8-12min；

24、加入洗涤溶液5，6000-10000rpm，离心8-12min。

25、更优选的，洗涤溶液洗涤更具体的为加入洗涤溶液1，8000rpm，离心10min；

26、加入洗涤溶液2，8000rpm，离心10min；

27、加入洗涤溶液3，8000rpm，离心10min；

28、加入洗涤溶液4，8000rpm，离心10min；

29、加入洗涤溶液5，8000rpm，离心10min。

30、优选的，所述变性溶液包含10-30mm tris，50-150mm nacl，4-6mmβ-me，7-9murea，ph7.5-8.5。

31、更优选的，所述变性溶液包含20mm tris，100mm nacl，5mmβ-me，8m urea，ph8.0。

32、优选的，所述稀释溶液的成分包括：40-60mm tris，4-6mm edta，450-550mm精氨酸，1.5-2.5mm gssg，0.8-1.2mm gsh，ph7.5-8.5。

33、更优选的，所述稀释溶液的成分包括：50mm tris，5mm edta，500mm精氨酸，2mmgssg，1mm gsh，ph8.0。

34、优选的，步骤(1)中加入1mm iptg进行诱导表达。

35、优选的，还包括步骤(7)：将ni柱纯化后的产物通过分子筛进行分选，将bmp-4的单体、二聚体和多聚体进一步分离。

36、优选的，步骤(7)具体为：

37、1)柱平衡：用pbs平衡分子筛；

38、2)上样：将ni柱纯化后的产物浓缩、离心处理后，将浓缩后样品注入上样环中，通过上样环上样；

39、3)洗脱液收集：待a280吸收峰大于10mau时，收集目的蛋白峰对应的产物，即为所需的bmp-4二聚体。

40、本发明还公开了一种骨形态发生蛋白bmp-4，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

41、本发明还公开了上述的骨形态发生蛋白bmp-4的编码基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

42、本发明的有益效果为：

43、本发明采用原核表达系统对bmp-4进行表达，并且获得了bmp-4蛋白的纯化工艺，解决了bmp-4真核表达体系表达量低、周期长及培养成本高的问题，并且为bmp-4的生产工艺提供了思路，原核表达系统是目前掌握最为成熟的表达系统。bmp-4由于序列中含有7个半胱氨酸c，造成了其独特的结构特点，在原核系统中以非活性的聚集体形式表达，本发明通过优化纯化工艺，使bmp-4的聚集体在体外溶解并重新折叠成天然结构(即bmp-4的二聚体，具有生物学活性)，获得高纯度的蛋白。