ARMS-PCR法检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区的核酸组合物、试剂盒

本发明属于基因检测，具体涉及一种arms-pcr法检测bcr-abl融合基因abl激酶区的核酸组合物、试剂盒。

背景技术：

1、慢性粒细胞白血病(cml)是一类造血系统的恶性肿瘤，95％以上cml病例具有bcr-abl融合基因，bcr-abl融合基因是由人体9号染色体abl基因和22号染色体bcr基因相互易位形成融合基因。它在cml发病机制和表型上起着重要的作用，它具有显著增强的酪氨酸激酶活性，可直接参与细胞向cml表型转化。

2、bcr-abl融合基因类型与表型密切相关。常见的主要有三种类型：

3、1)m-bcr主要断裂点在bcr基因e12-e16的5.8kb区域(又可叫做b1-b5)，大部分mrna类型为b2a2或b3a2，融合蛋白大约210-kda。见于大部分cml、1/3ph阳性b-all患者。

4、2)m-bcr主要断裂位点在外显子e2’和e2之间的54.4kb区域，产生e1a2类型的mrna，融合蛋白大约190kda。主要见于2/3的ph阳性b-all以及极少数cml患者中。

5、3)μ-bcr断裂点位于外显子e19下游，转录成e19a2类型的mrna，编码蛋白大小约230kda。主要见于慢性中性粒细胞白血病。

6、2001年tki药物伊马替尼作为治疗cml的药物问世，随后发现了伊马替尼耐药的病例，bcr-abl融合基因abl激酶区点突变能够减弱甚至消除伊马替尼结合。随后越来越多的tki药物以及耐药位点突变被发现，迄今为止已报道的耐药突变位点有九十多种，有些突变类型对多种tki药物耐药，白血病患者预后较差。

7、同一个病人不同时期的abl激酶区突变类型也可能存在演变。可能刚开始阶段突变克隆比例较低，一旦出现后会很快增高并导致疾病进展。也可能在疾病某一时期，原有克隆类型消失，新的克隆类型出现。耐药的突变往往出现于急变期，因此定期监测突变情况是很有必要的，可用于及时调整tki药物种类及剂量。针对某些预后不良的基因突变，在低水平较早检测出来具有更好的临床意义。已经发现的点突变主要集中于三大类别：atp结合区(p-loop)，尤其以g250e y253h e255k等；t315i突变；a-loop区，尤其以h396r。目前报道的突变中，以t315i耐药程度最高，几乎对所有酪氨酸激酶抑制剂均耐药，需尽早采取其他治疗方法。部分耐药突变耐药程度不高，可通过提高药物剂量达到效果。还有部分耐药突变患者可转用二代、三代等tki药物，作为伊马替尼替代药物。因此治疗前及治疗过程中，综合融合基因定量结果和abl激酶区突变结果可为患者制定更为精准的个体化用药指导。

8、目前用于检测abl激酶区突变位点检测的方法主要有，巢式pcr法和二代测序法。巢式pcr早些年得到了广泛应用，主要在于两步扩增能够提高特异性。但它很大的一个问题就是一轮扩增产物开盖容易造成气溶胶污染，并且一代测序灵敏度不够高。近些年来随着二代测序仪越来越普及，经二代测序法检测abl激酶区突变位点的应用也越来越广泛，极大提高了检测灵敏度，但实验成本相对较高，实验周期相对较长，在临床的应用中相对受限。

技术实现思路

1、本发明提出一种arms-pcr法检测bcr-abl融合基因abl激酶区的核酸组合物，用于解决现有技术检测灵敏度低、成本高，周期长的缺陷，拓宽了临床检测的应用范围。

2、基于此，本发明的技术方案如下：

3、一种arms-pcr法检测bcr-abl融合基因abl激酶区的核酸组合物，所述核酸组合物为f311l；f311i、t315a、f317lc、f317i、f317la、f317l、t315i、f359i、f359c、f359v、m351t、g250e、e255k、e255v、q252h、m244v、y253h、h396r 19种点突变设计的引物对及探针组。

4、进一步地，所述引物对及探针组包括：

5、t315i：如seq id no：1-2所示的引物对及如seq id no：3所示的探针；

6、f317l：如seq id no：1、4所示的引物对及如seq id no：3所示的探针；

7、g250e：如seq id no：5-6所示的引物对及如seq id no：7所示的探针；

8、f359v：如seq id no：8-9所示的引物对及如seq id no：10所示的探针；

9、e255k：如seq id no：5、11所示的引物对及如seq id no：7所示的探针；

10、y253h：如seq id no：5、12所示的引物对及如seq id no：7所示的探针；

11、h396r：如seq id no：13-14所示的引物对及如seq id no：15所示的探针；

12、m244v：如seq id no：5、16所示的引物对及如seq id no：7所示的探针；

13、q252h：如seq id no：5、17所示的引物对及如seq id no：7所示的探针；

14、e255v：如seq id no：5、18所示的引物对及如seq id no：7所示的探针；

15、f311l：如seq id no：1、19所示的引物对及如seq id no：3所示的探针；

16、f311i：如seq id no：1、20所示的引物对及如seq id no：3所示的探针；

17、f317la：如seq id no：1、21所示的引物对及如seq id no：3所示的探针；

18、f317lc：如seq id no：1、22所示的引物对及如seq id no：3所示的探针；

19、t315a：如seq id no：1、23所示的引物对及如seq id no：24所示的探针；

20、f317i：如seq id no：1、25所示的引物对及如seq id no：3所示的探针；

21、m351t：如seq id no：8、26所示的引物对及如seq id no：10所示的探针；

22、f359c：如seq id no：8、27所示的引物对及如seq id no：10所示的探针；

23、f359i：如seq id no：8、28所示的引物对及如seq id no：10所示的探针；

24、及内参：如seq id no：29-30所示的引物对及如seq id no：31所示的探针；所述探针序列的5’端采用报告基团修饰，探针序列的3’端采用淬灭基团修饰。

25、进一步地，所述探针为5’端fam修饰，3’端mgb修饰。

26、本发明的另一个目的在于，提出以上所述核酸组合物在制备检测bcr-abl融合基因abl激酶区试剂盒中的应用。

27、在上述应用中，所述试剂盒将引物对及探针组分成如下11管：

28、tube 1：引物序列如seq id no：1、19、20、23所示，探针序列如seq id no：3所示；

29、tube 2：引物序列如seq id no：1、22、25所示，探针序列如seq id no：3所示；

30、tube 3：引物序列如seq id no：1、21、4所示，探针序列如seq id no：3所示；

31、tube 4：引物序列如seq id no：1-2所示，探针序列如seq id no：3所示；

32、tube 5：引物序列如seq id no：8、28、27所示，探针序列如seq id no：10所示；

33、tube 6：引物序列如seq id no：8、9、26所示，探针序列如seq id no：10所示；

34、tube 7：引物序列如seq id no：5-6所示，探针序列如seq id no：7所示；

35、tube 8：所用引物序列如seq id no：5、11、18、17、16所示，探针序列如seq id no：7所示；

36、tube 9：所用引物序列如seq id no：5、12所示，探针序列如seq id no：7所示；

37、tube 10：所用引物序列如seq id no：13、14所示，探针序列如seq id no：15所示；

38、tube 11：引物序列如seq id no：29、30所示，探针序列如seq id no：31所示。

39、本发明还有一个目的，在于提出一种arms-pcr法检测bcr-abl融合基因abl激酶区试剂盒，包括如以上所述的核酸组合物。

40、进一步地，所述试剂盒还包括用于荧光定量pcr扩增的反应试剂。

41、本发明另一个目的，在于提出一种非诊断为目的检测bcr-abl融合基因abl激酶区的方法，其反应体系为12.5ul：

42、probe qpcr master mix 6.25ul

43、引物探针mix 3.25ul

44、cdna 2.5ul

45、引物终浓度为300nm，探针终浓度为200nm；

46、所述引物探针mix为如以上所述的核酸组合物。

47、进一步地，所述反应体系的反应条件为95℃5min；95℃25s，64℃20s，72℃20s，10个循环，不采集荧光；93℃25s，60℃35s，30个循环，采集荧光；72℃，20s。

48、相比现有技术，本发明的有益效果在于：

49、本发明根据bcr-abl融合基因abl激酶区19种常见突变设计以abl为内参的引物及探针序列，可实现在11孔内可完成19种常见突变及内参检测，操作简单，检测灵敏度可达1％。与其他常见分子生物学检测方法相比，大大降低检测周期并降低了实验成本，同时提高了实验灵敏度和准确性。