本发明属于微生物检测，尤其是一种基于argonaute可视化检测耐药菌的方法、装置及其应用，特别是一种基于pfago结合lamp扩增一管法同时双靶点检测耐药菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法及装置，命名为star(simultaneous dual-genetest ofmethicillin-resistant staphylococcus aureus based on argonaute-poweredportable andvisual biosensor)。
背景技术：
：：1、临床治疗中对抗菌药物的广泛使用导致病原菌耐药性逐年提高，对常见传染病的治疗产生了重大影响。世界卫生组织宣布，微生物耐药性是世界十大公共卫生威胁之一。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)是一种对β-内酰胺类药物具有耐药性的革兰氏阳性菌，医院感染和公共感染最重要的病原菌之一，mrsa会导致皮肤、软组织、骨骼和血液中的一系列严重疾病，并可能导致败血症和死亡，其感染的病死率高达63.1％。mrsa于1961年被首次分离和发现，最初仅局限于在医疗机构中传播感染。但到了20世纪80年代，社区获得性mrsa的病例陆续被报道。mrsa已在全球广泛传播，并已成为严重威胁人类健康的病原体之一。近年来，在我国食源性疾病溯源调查中也多次发现mrsa通过食物传播引起了严重的人类感染。mrsa对食品的污染可对广大消费者造成较大安全风险。在多种类食品的调查监测结果显示，mrsa在不同类型的食品中都有发现，其中鲜奶和生肉中mrsa污染率相对较高。食品中mrsa的早期诊断在保证人类健康和确保食品安全方面发挥着至关重要的作用。因此，建立快速、灵敏、可视化、便携化的检测手段对于应对突发性公共卫生事件是非常重要的。2、传统的mrsa检测方法主要分为三类：平板培养法、基于pbp2a蛋白的免疫检测、基于meca基因的核酸扩增方法，但都存在一定的局限性，培养法检测周期长，需要专业的操作人员；免疫检测法依赖于抗原抗体的反应，稳定性和灵敏度低；核酸扩增方法包括pcr、实时荧光定量pcr、数字定量pcr等，虽然灵敏度高，但需要昂贵的仪器和专业人员操作，无法进行现场检测。crispr/cas系统不仅被应用于基因编辑，也被广泛应用于核酸检测领域。尽管基于crispr/cas已经建立了检测mrsa的生物传感策略，且各有优势但是都是基于mrsa的特异性基因meca的单基因检测，不能严格解释其检测结果的准确性。通过crispr已经建立了多重检测方法，一方面，通过蛋白的正交反应，基于多种cas蛋白的核酸偏好性不同；另一方面，通过反应体系时空的分离实现。然而，由于其复杂的反应成分以及rna易降解等，可能会出现错误的诊断。3、argonaute是一种核酸引导的核酸内切酶，广泛存在于真核、原核等自然生物体内，可以分为真核argonaute(eago)和原核argonaute(pago)。eago在rna干扰(rnai)中起着关键作用，pago参与宿主防御机制以保护其免受外源核酸入侵。pago的识别和切割由dna或rna引导，而不限于靶中的pam序列。目前，嗜热pago，如thermus thermophilusargonaute(ttago)和pyrooccusfuriosus argonate(pfago)被广泛研究和应用。pfago是一种起源于古细菌激烈火球菌的ago蛋白，在80-99.9℃环境中发挥活性。pfago可以利用长度超过14nt的5'磷酸化dna引导切割单链和双链dna靶标。通过严格的碱基互补配对原则来识别和切割靶标，是pfago实现多重检测的前提。设计不同标记的荧光探针，通过与靶标碱基互补配对，可以实现高特异性的多重检测平台。近年来，由于其可编程性和高特异性，基于嗜热pago(例如，pfago和ttago)的核酸检测技术已被研究和建立，sars-cov-2、hpv、甲型/乙型流感病毒以及稀有基因的检测。与crispr/cas系统相比，基于pfago的多重检测具有单一蛋白参与、无pam依赖性和无rna参与等独特优势。本研究首次利用pfago集成lamp扩增双靶点检测耐药菌，同时具有高灵敏度和高特异性，并开发了一个便携式的3d打印装置可以实现荧光结果的可视化。4、通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。技术实现思路1、本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种基于argonaute可视化检测耐药菌的方法、装置及其应用，特别是一种基于pfago结合lamp扩增一管法同时双靶点检测耐药菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法。2、本发明解决技术问题所采用的技术方案是：3、一种基于pfago结合lamp扩增一管法同时双靶点检测耐药菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，所述方法包括如下步骤：4、(1)提取待检测菌的基因组；5、(2)选择耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa的基因组中特异性基因nuc和meca序列设计用于mrsa检测的lamp引物；6、(3)将混合的lamp扩增体系放置于65℃孵育30min，得到lamp扩增产物；7、(4)将lamp扩增产物加入pfago反应体系中，在95℃孵育15min，反应结束后通过酶标仪进行荧光值测量，或者将反应管放置于3d检测装置中，获得检测结果；8、当双靶标同时存在，与阴性对照组即无靶标的荧光值相比，阳性组即有靶标的双荧光皆有增长，且在302nm紫外照射下为黄色荧光，则证明检测菌为mrsa，否则证明无mrsa。9、进一步地，每总体积为25μl的lamp扩增体系具体如下：10、buffer 2.5μl，10×引物mix-nuc基因扩增2.5μl，10×引物mix-meca基因扩增2.5μl，dntps mix3.5μl，100mm mgso42μl，bstdna聚合酶0.5μl，待检测菌的基因组2μl，ddh2o9.5μl；11、其中，buffer成分为：200mm tris-hcl，ph 8.8，500mm氯化钾，100mm硫酸铵，20mm硫酸镁，质量浓度为1％的tween-20；12、10×引物mix-nuc基因扩增包括：16μm fip，16μm bip，2μm f3，2μm b3，4μm loopf，4μmloop b；fip、bip、f3、b3、loop f、loop b的基因序列依次为seq id no.1至seq idno.6；13、10×引物mix-meca基因扩增包括：16μm fip，16μm bip，2μm f3，2μm b3，4μm loopf，4μmloop b；fip、bip、f3、b3、loop f、loop b的基因序列依次为seq id no.7至seq idno.12；14、dntps mix包括：10mm datp，10mm dttp，10mm dctp，10mm dgtp，10mm dutp；15、进一步地，所述pfago反应体系为：16、6μmpfago，0.5μm、nuc基因引导dnas，0.5μm、meca基因引导dnas，0.2μm荧光探针a，0.2μm荧光探针b以及反应缓冲液；17、其中，nuc基因引导dnas包括3条相应的引导dna即guide dna 1、guide dna2、guide dna3，三条guide dna总浓度为0.5μm，三条guide dna的摩尔浓度比为1:1:1，三条guide dna的基因序列依次为seq id no.21至seq id no.23；所述荧光探针a的基因序列为seq id no.24；18、meca基因引导dnas包括3条相应的引导dna即guide dna 1、guide dna2、guidedna3，三条guide dna总浓度为0.5μm，三条guide dna的摩尔浓度比为1:1:1，三条guidedna的基因序列依次为seq id no.25至seq id no.27；所述荧光探针b的基因序列为seq idno.28；19、所述反应缓冲液的组成为：ph 7.5的hepes、nacl和mncl2的混合液，hepes-naoh：nacl：mncl2的摩尔比为20：100：0.5；hepes-naoh与pfago的摩尔比为20：6；20、或者，所述荧光探针a为与ssdnaa互补的5’rox和3’bhq2双标记；所述荧光探针b为与ssdna b互补的5’fam和3’bhq1双标记。21、进一步地，所述方法通过当靶标dna存在时，pfago能够在引导dna的引导下切割靶标dna，产生的次级ssdna，能够作为新的引导dna与空-pfago结合并引导其特异性切割荧光探针，pfago的切割是基于严格的碱基互补配对，基于此设计双靶点检测平台。22、进一步地，当体系中存在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌时，经过lamp扩增能够得到nuc扩增子和meca扩增子，pfago在相应的引导dna的引导下分别切割nuc扩增子和meca扩增子，得到次级ssdna a和ssdnab，作为新的引导dna分别引导pfago切割荧光探针a和荧光探针b，在3d打印装置中能够观察到荧光呈黄色(因rox红色荧光和fam绿色荧光同时存在)；当体系中存在非耐药的金黄色葡萄球菌时，经过lamp扩增仅能够得到nuc扩增子，在相应引导dna引导pfago切割后，得到次级ssdnaa引导pfago切割荧光探针a，在3d打印装置观察到的荧光呈红色；当体系中存在除金黄色葡萄球菌外的耐甲氧西林葡萄球菌时，经过lamp扩增仅能够得到meca扩增子，在相应引导dna引导pfago切割后，得到次级ssdnab引导pfago切割荧光探针b，在3d打印装置观察到的荧光呈绿色；当体系中不存在以上三种菌时，无扩增子且无荧光探针被切割，3d打印装置中未观察到荧光。23、进一步地，所述3d打印装置包括手机支架、紫外透射滤光片、紫外灯管、隔板、外壳、盖子、手机拍照孔、金属加热块、加热模块外壳、温控模块，所述外壳沿水平方向设置，该外壳的纵向一侧上可拆卸紧密相连接设置盖子，该外壳内呈中空的密封状，外壳的中空内部紧密相连接设置隔板，该隔板沿水平方向设置，隔板上方外壳内的中上部紧密相连接设置紫外透射滤光片，该紫外透射滤光片能够透射302nm的光，紫外透射滤光片的上表面上能够放置盛装待检测的反应完毕体系的试管，紫外透射滤光片下方的外壳内相连接设置紫外灯管，紫外灯管间隔设置于隔板上方，紫外透射滤光片上方的外壳顶部上设置手机拍照孔，手机拍照孔外侧的外壳上相连接设置手机支架，该手机支架上能够可拆卸相连接设置手机，且手机的相机镜头能够正对紫外透射滤光片设置；24、所述隔板下方的外壳的中空内部设置有金属加热块、加热模块外壳和温控模块，所述金属加热块设置于加热模块外壳内，金属加热块沿水平方向设置，且金属加热块内沿均布间隔制有32个试管放置加热位，试管放置加热位与盛装反应体系的试管的形状相吻合设置，且试管能够与试管放置加热位可拆卸相连接设置，金属加热块能够对设置于试管放置加热位的试管进行加热操作；25、所述温控模块通过温控按钮、电源与金属加热块相连接设置，温控模块能够调节金属加热块的加热温度。26、进一步地，所述装置还包括温控显示屏，温控显示屏与金属加热块相连接设置，温控显示屏能够显示金属加热块的加热温度；27、或者，所述金属加热块自上而下依次通过加热板、隔热垫与加热模块外壳相连接设置，加热模块外壳通过推拉板与外壳可拆卸相连接设置；28、或者，所述滤光片通过滤光片固定卡扣与外壳相连接设置；29、或者，所述温控模块通过导线与电源相连接设置，导线通过导线导出口9与外部电源相连接设置；30、或者，所述外壳的尺寸为226mm×125mm×164mm，所述外透射滤光片的尺寸为200mm×100mm×3mm，所述紫外灯管能够发射302nm的紫外光，4w，且该紫外灯管由电池供电，所述手机支架的尺寸为77mm×25mm×25mm，所述手机拍照孔的直径为18mm；31、或者，所述手机支架能够360°自由旋转和自由调整宽度；32、或者，所述3d打印装置采用1.8mm黑色聚乳酸(pla)长丝通过3d打印制成；33、或者，所述3d打印装置的使用方法如下：通过按钮调节温度，使金属加热块达到目的温度，可以依次在金属加热块中完成核酸提取、lamp扩增及pfago切割反应，反应结束后，将反应管横放于紫外透射滤光片上表面，打开紫外灯，将智能手机放置在手机支架上，调整手机支架将摄像头对准手机拍照孔，进行拍摄获得检测结果。34、进一步地，包括如下步骤：35、(1)在lb培养基中接种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa，37℃摇床振荡培养12h，利用磁珠提取法对mrsa基因组进行提取，将基因组加入到lamp双靶点扩增体系中，将金属加热块设置为65℃孵育30min，得到的扩增产物加入pfago体系进行反应，将金属加热块设置为95℃孵育15min；36、(2)将得到的不同浓度的mrsa撒入到样品中，利用磁珠提取法提取样品中不同浓度的mrsa基因组，加入到lamp双靶点扩增体系中，将金属加热块设置为65℃孵育30min，将扩增产物加入到pfago体系中进行反应，将金属加热块设置为95℃孵育15min。37、(3)反应结束后将反应管置于3d打印装置的紫外透射滤光片中，通过智能手机拍照获得检测结果，并使用app对结果进行采集和分析。38、进一步地，所述方法的最低检测限度为10-100cfu/ml，并且能够检测上至107cfu/ml；所述方法的检测时间从核酸提取、lamp扩增、pfago切割及信号输出仅需要65min。39、如上所述的方法在检测耐药菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方面中的应用。40、本发明取得的优点和有益效果：41、1、本发明方法为lamp-pfago进行检测的方法，应用此方法分为核酸提取、核酸扩增、荧光信号读出三部分，即可检出mrsa。42、2、本发明建立的检测方法检测限低，最低检测限度为10-100cfu/ml，并且能够检测上至107cfu/ml，检测范围较宽，并且灵敏度高。43、3、本发明建立起来的检测方法特异性强，以检测mrsa为例，对于大肠杆菌、酵母菌、根瘤农杆菌等微生物没有明显的荧光信号，证明本发明对于mrsa具有良好的选择性，而不受其他微生物的影响。44、4、本发明设计的lamp-pfago检测体系，可以在一管中对双靶点基因同时扩增，并且可以在同一管同时对双靶点产物进行识别和切割，产生双荧光信号。45、5、本发明设计的lamp-pfago检测体系，不仅可以准确的检测mrsa，仅需要设计引物序列，以及相应的引导dna序列，即可用于多重检测其他病原微生物，该检测方法准确，检测范围较宽，方法简单快捷，易操作。46、6、本发明设计的3d打印装置，实现对检测所用仪器的集成且构造简单，通过设置可得到不同反应所用的温度区间，并通过紫外透射可以直观的得到荧光结果，根据不同颜色的荧光可以判断检测结果，从而使荧光结果可视化，无需专业仪器设备。47、7、本发明建立的方法检测时间短，从核酸提取、lamp扩增、pfago切割及信号输出仅需要65min，优于大部分现有检测技术。48、8、经过与其他传统方法的比较，如平板培养和qpcr，本发明设计具有方法简单、快速、灵敏性高等优点，同时本发明极大地缩减了检测成本、缩短了检测时间，因此便于对样品进行大规模快速检测。49、9、本发明方法基于argonaute结合lamp扩增的检测结果具有高灵敏度和高特异性，提供一种基于pfago结合lamp扩增，并通过便携式设备直观的得到检测结果的技术，使得灵敏、选择性、准确地在现场短时间检测耐药菌成为可能。该方法为精准检测耐药菌提供了一种新的思路。本实验检测的耐药菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。50、10、本发明方法基于argonaute，能够高灵敏、高特异检测耐药菌，并通过3d打印装置输出荧光信号，为现场快速灵敏的检测提供了一种可能。当前第1页12当前第1页12