基于利什曼原虫K26重组抗原的检测黑热病循环抗体的免疫层析试条的制作方法

本发明属于生物检测领域，涉及免疫层析试条，具体来说是一种基于利什曼原虫k26重组抗原的检测黑热病循环抗体的免疫层析试条。

背景技术：

1、内脏利什曼病或称黑热病，是由杜氏利什曼原虫种团(leishmania donovanicomplex)或婴儿利什曼原虫(l.infantum)/恰氏利什曼原虫(l.chagasi)的原虫寄生于人体的淋巴—巨噬细胞系统所引起的一种寄生虫病，由媒介白蛉叮咬传播。该病在世界范围内流行甚广，准确检测感染和诊断是监测工作急需和治疗的关键所在，因此，对黑热病诊断技术的研究始终受到重视。

2、以骨髓、脾等穿刺物涂片染色镜检的方法是黑热病最古老的诊断方法，迄今仍是黑热病诊断的“金标准”。国外报道显示骨髓和淋巴结穿刺物涂片镜检敏感性分别为60％～75％和30％～50％，国内报道以骨髓、淋巴结、脾穿刺涂片镜检检出率依次为:80～90％、46～87％、96～98％。由于这种检测方法对操作人员的技术要求非常高，在疾病诊断与流行病学调查中应用受到限制。

3、免疫学方法在黑热病诊断上的应用越来越受到重视，最有效的免疫学诊断方法是应用纯化天然抗原或重组抗原检测黑热病人特异抗体，常用检测方法有间接血凝法(indirect haemagglutination assay；iha)、酶联免疫吸附法(enzyme linkedimmunosorbent assay；elisa)、酶联免疫电转移印渍法(enzyme-linkedimmunoelectrotransfer blot assay；eitba),以及金标免疫点印渍法(gold-labelleddot blotting；gdb；俗称膜法或渗滤法)和免疫层析试条法(immunochromatographicstrip test；ict)。

4、其中免疫层析试条法(ict)因其不需要冷链系统保存试剂，操作简单，结果快速直观，对仪器设备及操作人员的要求低，非常适合现场使用。

5、这些方法的性能高度依赖于抗原的类型，来源和纯度。利什曼原虫粗抗原检测敏感性高，但存在不易标准化的问题，为了获得实用的有较高敏感性和特异性的抗原，研究者致力于生产新的不同的重组抗原用于内脏利什曼病的诊断。burns等从恰氏利什曼原虫的类kinesin基因中获得了基因片段k39，并证实其存在于所有引起内脏利什曼病的利什曼原虫虫种(株)中。美国inbios公司以此基因片段的重组抗原k39(recombinant k39,rk39)制备的免疫层析试条在现场应用中取得较好的效果，是目前唯一商品化的快速检测内脏利什曼病的产品，但该试剂盒价格昂贵，从而限制了该试剂盒的推广和普及。因此，亟待开发我国自己的检测黑热病试剂盒。

6、有研究者从恰氏利什曼原虫中鉴定出了另一种很有前景的诊断抗原k26抗原，k26蛋白也被称为亲水性酰化表面蛋白b(hydrophilic acylated surface protein b，haspb)，在硕大利什曼原虫中又称基因b蛋白(gbp)，存在于前鞭毛体和无鞭毛体的质膜上。k26抗原编码基因编码含有多个由10～11个氨基酸残基构成的重复序列。有报道表明，在elisa试验中，rk26的敏感性高于rk39，特别是在感染的早期。但不同的利什曼原虫研究结果存在差异。

技术实现思路

1、本发明提供一种基于利什曼原虫k26重组抗原的检测黑热病循环抗体的免疫层析试条，所述的这种基于利什曼原虫k26重组抗原的检测黑热病循环抗体的免疫层析试条要解决现有技术的方法检测黑热病操作繁琐、成本高昂的技术问题。

2、本发明提供了一种利什曼原虫k26重组抗原，作为免疫学方法检测亲内脏利什曼原虫感染体内循环抗体的靶向分子，所述利什曼原虫k26重组抗原核苷酸序列如seq idno：1所示，氨基酸序列如seq id no：2所示：

3、本发明还提供了本一种基于利什曼原虫k26重组抗原的检测黑热病循环抗体的免疫层析试条，包括一个样品垫，所述的样品垫的一端紧密连接于含有胶体金标记探针的胶体金探针垫的一端，所述的含有胶体金标记探针的胶体金探针垫的另外一端与纤维素膜的一端紧密连接，所述的纤维素膜的另外一端紧密连接吸水垫的一端，所述胶体金探针垫是由胶体金标记的金黄色葡萄球菌a蛋白或链球菌g蛋白探针组成，所述纤维素膜上靠近胶体金探针垫的一端分别设置一条检测线，由权利要求1所述的利什曼原虫k26重组抗原组成，在检测线和吸水垫之间的纤维素膜上设置一条质控线，所述的质控线由特异性结合所述胶体金标记探针二抗抗体组成。

4、进一步的，免疫层析试条背面设置一个起支撑作用的背板。

5、进一步的，将所述带有背板的免疫层析试条装入一个盒体中，该盒体对应于样品垫的部位设有加样孔，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗以及检测线和质控线的位置标识。

6、进一步的，所述的利什曼原虫k26重组抗原按如下方法制备：k26核苷酸序列如seqid no：1全基因合成，通过bamhi与xhoi插入到pet32a载体中，构建k26重组蛋白表达载体。将表达载体转化至e.coli dh5a，扩增培养后提取质粒，测序验证序列正确者，转化入e.coli bl21(de3)感受态中，挑取单克隆在1mm的iptg条件下37℃诱导4h。使用蛋白抽提剂，蛋白酶抑制剂、核酸酶和溶菌酶裂解表达细菌，用histrap ff亲和层析柱纯化表达产物。

7、具体的，所述纤维素膜可以是硝酸纤维素膜(nc膜)或醋酸纤维素膜或混合膜；所述胶体金探针垫为玻璃纤维膜或聚脂纤维膜；所述样品垫可以是玻璃纤维或聚酯纤维或混合纤维；所述吸水垫由吸水材料制备，如吸水纸。

8、具体的，所述纤维素膜宽度控制在20～30mm；所述吸水垫可宽度为20～40mm，所述胶体金探针垫的宽度为5～10mm；所述样品垫宽度为10～40mm。

9、进一步的，检测线上的利什曼原虫k26重组抗原工作浓度为0.1～2.0mg/ml，喷涂量为0.5～1μl/cm；质控线二抗抗体工作浓度为0.1～2.0mg/ml，喷涂量为0.5～1μl/cm；胶体金标记的金黄色葡萄球菌a蛋白(spa)或链球菌g蛋白(spg)探针的工作浓度(以蛋白浓度计)：8～40μg/ml，喷涂量为40～50μl/cm。

10、进一步的，所述的免疫层析试条背面设置一个起支撑作用的背板，背板材料的选择是多种多样的，可以是塑料板，如聚氯乙烯板(pvc)等。

11、进一步的，将所述带有背板的免疫层析试条切成3～5mm宽，装入一个盒体中，该盒体对应于样品垫的部位设有加样孔，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗以及检测线和质控线的位置标识。

12、本发明分别采用胶体金标记的金黄色葡萄球菌a蛋白(spa)或链球菌g蛋白(spg)作为检测探针，附着于胶体金探针垫上。检测过程中，复溶的胶体金标记探针可以与受试者血样中的循环抗体特异性结合，形成抗体探针复合物。

13、本发明将利什曼原虫k26重组抗原固定在纤维素膜上，形成一条检测线。当受试者血样流过检测线时，抗体探针复合物会捕获固定在纤维素膜上的利什曼原虫k26重组抗原，形成肉眼可见的沉淀线(色带)。

14、本发明将可与检测探针特异性结合的二抗抗体固定在纤维素膜上作为质控线。胶体金标记探针是金黄色葡萄球菌a蛋白(spa)或链球菌g蛋白(spg)，相应的质控线采用抗金黄色葡萄球菌a蛋白(spa)或链球菌g蛋白(spg)的igg抗体。无论待检样品中是否含有k26重组抗原的抗体，本发明的诊断试条质控线位置总能形成色带，该条色带是判定检测过程是否正常和诊断试条是否变质的标准。

15、与胶体金标记探针特异性结合的质控线不限于使用抗金黄色葡萄球菌a蛋白(spa)或链球菌g蛋白(spg)的igg抗体，也可采用金黄色葡萄球菌a蛋白，链球菌g蛋白，或者采用其他动物的单抗或多抗，同样能实现本发明的发明目的，这是领域的一般技术人员都知晓的。

16、本发明的免疫层析试条具有以下优点：

17、(1)敏感性及特异性高：实验室考核结果显示，本发明的免疫层析试条总的敏感性为91.82％，特异性为100.00％；

18、(2)检测方法简单、快速：检测过程中标本处理简单，血清或全血都可以直接使用，无需处理，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，标本中的抗体经5～10分钟左右的纸层析后，即可出现肉眼可见的沉淀线，从而为黑热病人的治疗争取了时间，很适合现场和基层使用；

19、(3)本发明的免疫层析试条可以同时应用与人、畜和野生动物感染的现场检测，有助于寻找确定传染源，在疾病预防控制工作中有重要意义；

20、(4)稳定性好，易于保存。成本低廉，易于进行工业化生产。本发明将在检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病及其相关疾病的诊断和治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。

21、(5)本发明的免疫层析试条检测亲内脏利什曼原虫感染(黑热病)的体内循环抗体，具有简便性、敏感性、特异性和快速性的优点，适于临床和现场使用。