一种高通量分离、培养和鉴定微生物的方法与流程

本发明涉及微生物，尤其涉及一种高通量分离、培养和鉴定微生物的方法。

背景技术：

1、微生物在医药、环保、化工、材料等领域均具有重要的应用潜力。近几年，肠道微生物被证明对动物和人体均具有重要的益生作用。来源于极端环境的微生物也被证实可以帮助修复受污染的土壤和水体。此外，微生物来源的天然化学产物经常被开发成药物，并且可以使用特定的微生物对特定化合物进行生物合成。因此，微生物是重要的产业开发资源。

2、微生物的研究、开发和利用，首先需要从环境、土壤、粪便中对单个微生物进行分离培养，获得纯培养物，但因微生物个体极小，且环境中混杂了多种多样微生物，如何对微生物进行纯种分离培养一直是微生物研究过程中的难题。传统方法一般是将环境样品制备成悬液，稀释到足够程度后，涂布或划线在固体平板培养基上，培养一段时间后，通过肉眼观察培养出来的菌落，再行反复划线分离，最终获得纯培养菌种。该方法操作繁琐，且存在如下难以克服的弊端。第一，平板培养时，多种微生物会生长在一起，其中包括生长快速的生长缓慢的微生物，通常生长快速的微生物会长出一个较大的菌株，可能会遮蔽生长缓慢的微生物；且生长快速的微生物会快速消耗培养基中的营养成分，导致生长缓慢的微生物因缺乏水分或者营养而无法生长。第二，样品中一般含有大量的真菌孢子，在平板分离过程中难以去除，其中霉菌的菌丝生长蔓延速度极快并显著抑制细菌的生长，导致细菌无法存活，分离失败。第三，分离培养后，需要收集菌落，提取dna，进行测序鉴定菌种。平板分离后，需要大量人工挑取菌落，再行液体培养才能收获菌体进行dna提取，操作极为繁琐。上述原因，导致平板分离的方法很难大规模、批量化的应用于微生物的分离培养，对微生物菌种资源开发不利。

3、另外一种常见的可以用于微生物分离培养方法是液体稀释培养法，即将样品进行震荡或者研磨后，制备成悬液，对悬液进行梯度稀释，再分配96孔板的到不同孔中进行液体培养，理论上，当稀释到一定程度后，每个孔内将最多只含有一个微生物细胞，经过培养后，可以批量获得纯种微生物。这一方法理论上可行，可以进行大规模分离培养。但是，在实操过程中，研究人员往往难以通过该方法高效的获得大量菌种。首先，样品中的细菌等微生物并非是以单细胞分散的形式存在于样品中，微生物与微生物之间或者微生物与土壤颗粒之间是紧密粘附在一起。常规的研磨、震荡等方式并不能很好的将微生物分散成单个体悬液，这就导致部分微生物无法被分离、或者多个微生物混杂在一个孔内，导致收获的微生物不纯。第二，由于微生物是在不断生长或死亡的，对于同一个悬浮液样品可培养微生物的浓度也是在不断变化的。现有的方法是通过梯度稀释，对不同稀释浓度的悬液均进行大量分配到96孔板中，时常出现因稀释度不合适，导致因稀释度不足而造成所有孔位均有细菌生长，同一孔内有多种细菌，导致不纯。也会出现稀释度过高，多数孔内没有细菌生长，导致分离工作量增大。因此，需要开发一种可行的测定可培养微生物密度的方法。第三，液体培养是以肉眼观察培养液是否浑浊来判断是否存在菌体。不同种类微生物的生长速度差距很大。常规室温下，有的微生物一天内即可浑浊，有的则需要长达2周。在批量化培养过程中，如果依旧以菌液是否浑浊来判断是否有微生物生长，则全部孔都需要培养2周或以上。对于快速生长的细菌，长时间培养1-2周后，会因营养耗竭而死亡，或菌体活力下降而导致后续冷冻保存后难以复苏。鉴于上述原因，使用液体稀释培养的方法，在实际操作过程中也难以进行规模化、高通量的微生物分离培养。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明公开了一种高通量分离、培养和鉴定微生物的方法，可以从样品中高通量的分离培养微生物，可以快速、批量化的收获尽可能多的单孔纯种培养物。

2、对此，本发明采用的技术方案为：

3、一种高通量分离、培养和鉴定微生物的方法，包括如下步骤：

4、步骤s1，对混杂微生物的样品进行预处理，加入含有甘油、壳寡糖或聚乙二醇的pbs缓冲液，混匀，使微生物分散形成单细胞的微生物悬液，静置，取上清液作为待分离样品，混匀、分装成小管后置于冷冻环境保存；

5、步骤s2，对步骤s1中得到的待分离样品随机取样，对取样的样品使用含有cck8的液体培养基进行梯度稀释，然后于20-37℃环境中进行预培养2-7天，统计长菌率，得到可培养微生物的密度；

6、步骤s3，根据得到的可培养微生物的密度，得到长菌率介于10％-35％的稀释度，按此稀释度，对样品解冻后加入含有cck-8的液体培养基，混匀，分液后于20-37℃环境中培养3-7天，收集有颜色变化和有明显浑浊的孔中的液体，冷冻保存活体菌种或进行菌种鉴定。进一步的，用于冷冻保存活体菌种的，将收集的液体加入20％甘油混匀后冷冻保存；用于菌种鉴定的，液体经离心去除上清后进行菌种鉴定。

7、此技术方案提供了一种从混杂多种微生物的样品中将分离、培养细菌、并进行测序鉴定的方法，采用该方法可以更好的对微生物进行分散，形成单细胞悬液；该方法通过梯度稀释后进行预培养确定样品中可培养微生物密度，并通过加入的cck8，可以灵敏的指示微生物生长，缩短了培养时间、降低了培养成本，更重要的是避免的长时间培养菌种老化导致的冷冻保存后无法复苏的问题。通过改进样品冷冻、保存和分离的方法，确保同一个样品在不同时间进行分离培养时其内部可培养微生物的密度不变，批次间分离培养的可重复性高。总的来说，该方法可以用于大规模、批量化分离、培养并鉴定单孔纯种微生物，而且收获到的单孔纯种微生物更多，操作更简便，综合成本更低，且后期微生物复苏的功率更高。

8、作为本发明的进一步改进，步骤s1中，对于水样，经过离心去除大部分上清后，向剩余液体中加入终浓度为0.2-0.8g/l的壳寡糖或1-5g/l的聚乙二醇，涡旋震荡5min以上，得到单细胞的微生物悬液；

9、对于固体样品，比如粪便、土壤、沉积物等样品，取1-5g样品，加入5-20倍体积的含有0.2-0.8g/l的壳寡糖、或1-5g/l的聚乙二醇的20％(体积比)甘油的pbs缓冲液，涡旋震荡5min，形成分散悬液，自然沉降10-20min取上清，或使用1.6μm以上孔径的滤膜进行过滤除去大颗粒物质得到单细胞的微生物悬液。

10、作为本发明的进一步改进，所述聚乙二醇的分子量为200-2000。

11、作为本发明的进一步改进，步骤s1中，向得到的微生物悬液中加入20％甘油pbs缓冲液，涡旋混匀后分装至保存管中，放入-80℃环境中保存。其中，所有保存管应在冰箱中保存不少于12小时，再进行后续实验，每次开展实验时均需从冰箱中取出一只新的样品，未用完的样品直接丢弃，不得重新放回冰箱。上述操作的目的在于保证每个样品管仅被冻融过一次，确保后续不同时间进行的分离操作重复性一致。

12、作为本发明的进一步改进，步骤s2中，取1ml样品加入到9ml含有1x cck8的液体培养基进行梯度稀释；其中，所述1x cck8为溶液中含有300mg/l的2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐和6mg/l的1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯。

13、作为本发明的进一步改进，所述液体培养基在常规浓度上进行5-10倍稀释后使用。

14、作为本发明的进一步改进，所述液体培养基为r2a或2216e。

15、作为本发明的进一步改进，将经过梯度稀释获得的溶液分配至96孔深孔板中，每个稀释梯度分配10-20个孔，每孔含有0.2-0.4ml培养基，同时分配10个不含菌的培养基作为对照，以检测培养基和操作过程是否有污染；

16、对于厌氧细菌，在厌氧工作站内进行操作，在液体表面加入150～300μl灭菌的液体石蜡，并贴上不透气膜；对于好氧菌，在96孔板表面贴上透气膜，将96孔板置于100-200rpm转速的摇床上进行培养；将上述96孔板置于20-37℃环境中进行培养2-7天；

17、培养期间每天观察各孔的情况，如该孔变色，说明孔内存在微生物生长；预培养结束后，统计每个稀释度有菌生长的孔数占总分离孔数的比例即长菌率，在此基础上，计算长菌率介于10％-35％的稀释度作为大量培养的稀释度，并选择以此稀释度进行下一步的大量分离培养。

18、作为本发明的进一步改进，步骤s3中，按照步骤s2得出的10-35％长菌率对应的稀释度，在解冻后的样品中加入经4℃预冷的含有cck-8的液体培养基进行稀释，进行磁力搅拌，使细菌在培养液中处于混匀状态，同时将培养基维持在4℃环境；

19、将上述稀释后的培养基分配至96孔板中，每块板分配94个孔，留2个孔用于加入空白培养基作为对照，每孔加入0.2-0.4ml培养基，按照步骤s2中的预培养的步骤培养3-7天；

20、培养结束后，收集有颜色变化或有明显浑浊的孔中的液体，将收集的液体一部分加入20％甘油混匀后冷冻保存活体菌种，另一部分进行菌种鉴定。

21、作为本发明的进一步改进，将收集的液体转入2块新的96孔板中，一部分加入20％甘油混匀后冷冻保存活体菌种，另外一部分经离心去除上清后，用于dna提取、pcr扩增、测序，用于菌种鉴定；同一个孔的菌液在两块96孔板的上的位置对应，并于后续将测序结果与或菌株对应。每块96孔板上收集94个菌株，另外2个孔用于进行后续dna提取和pcr扩增的阴性对照。

22、作为本发明的进一步改进，所述dna提取采用商业化的核酸提取仪配合磁珠法的细菌基因组dna提取试剂。

23、作为本发明的进一步改进，根据分离微生物的种类不同，选择16s、18s或its部分序列进行pcr扩增和测序，在通用正向和反向引物的5’端外侧，均设置6-8个碱基的barcode区域，得到一系列带有不同barcode的引物组，正向与反向引物再行组合后，得到不同的引物组合；

24、在进行pcr扩增时，一个孔使用一种引物组合，不同孔使用不同的引物组合，并记录该孔对应的引物外侧的barcode序列；进行pcr扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳，收集有正确扩增条带的pcr产物，将不同孔的pcr产物混合到一起，作为一个pcr产物混合样品；

25、对pcr产物混合样品进行纯化、文库构建和高通量测序，测序数据经过滤去除不合格的数据后，用于序列分析和菌种注释，根据序列两侧barcode的信息，确定其所对应的96孔板及在96孔板上的位置，对应冷冻保存的活菌。

26、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

27、采用本发明的技术方案，可以更好的对微生物进行分散，并可以确定样品中可培养微生物密度，灵敏的指示微生物生长，收获到的单孔纯种微生物更多，且后期微生物复苏的成功率高，操作更简便，可批量化完成分离培养和对菌种进行测序鉴定，大幅降低了菌种测序鉴定的工作量和综合成本。