假俭草促生长基因EoBr2及其植物表达载体和应用

本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及假俭草促生长基因eobr2及其植物表达载体和应用。

背景技术：

1、假俭草[eremochloa ophiuroides(munro.)hack.]属禾本科黍亚科蜈蚣草属，是该属中唯一可用作草坪草的优良暖季型c4草本植物。假俭草主要分布于我国长江流域及以南地区，是目前公认的起源于我国的最好的草坪草，其叶型优美且外观均一，形成的草坪平整美观，同时具有固土能力强，耐酸耐瘠薄、病虫害少、养护水平极低(每年修剪次数可低到1-2次)等优势(刘明稀等,2012；islam and hirata,2005)。在我国甚至全世界水资源、能源资源日益严峻的情况下和我国节能减排的指导方针下，假俭草以其耐贫瘠，病虫害少和管理强度低的特点占据了显著的优势，在我国生态环境建设中的具有广泛的应用前景。然而，与两大应用最广的暖季型草坪草狗牙根和结缕草相比，假俭草略逊一筹。其生长缓慢，成坪速度较慢，造成成坪过程中易受杂草入侵(刘建秀和贺善安,1996；刘建秀,2011，朱兆华等，2017)，增加了其成坪期间的养护成本，严重影响了其广泛推广应用。

2、生长素是重要的植物激素之一，可以调控植物的多种形态发育和器官形成过程(adamowski and friml,2015)。生长素主要在茎尖和根尖合成，通过向基性(basipetal)的极性运输到达效应部位发挥作用，是目前已知的唯一具有极性运输的植物激素。生长素的极性运输决定了其在植株不同部位的分布梯度,从而决定了胚的发育、器官形成、顶端优势、维管束分化及伸长生长等多个植物生长发育过程(friml and wísniewska,2005)。目前研究表明参与生长素极性运输的载体主要有三大蛋白家族：aux1/like aux1(auxinresistant 1/like aux1,aux1/lax)家族，pin(pin-formed,pins)家族和abc(atp-bindingcassette,abc)/mdr(multidrug resistance,mdr)/pgp(p-glycoprotein,pgp)家族成员(friml,2003)。现有研究证明，生长素运输相关基因能够影响植物的生长速度和根系发育。拟南芥aux1突变后造成侧根减少(marchant et al.，2002)，lax3突变则造成侧根出现延迟(swarup et al.，2008)。水稻ospin9过表达株系分蘖数变多和株高变高(hou et al.,2021)。拟南芥atpgp1突变后造成拟南芥在弱光下下胚轴伸长(sidler et al.，1998)，atpgpg19突变则造成拟南芥半矮化表型(noh etal.，2001)，atpgp1/atpgp19双突变体则表现出更明显的半矮化表型(geisler et al.，2003)。玉米zmbr2(zmpgp1)和高粱sbdw3突变后造成节间变短，株高降低，叶夹角变小。高粱sbdw3第五个外显子一个882bp重复片段的插入在全球159个高粱品种中的73个品种中存在，证明该片段的插入已经在高粱中大范围应用(xing et al.,2015；wei et al.,2018)。通过对68份玉米地方品种、349份玉米自交系和32份大刍草材料进行重测序分析发现，上述材料中存在多个zmbr2(zmpgp1)单倍型，证明在玉米驯化过程中，zmbr2(zmpgp1)随着密度提高的需求而被驯化选择(li et al.,2019)。

3、假俭草的育种主要以传统育种方式为主，育种周期长、效率低。利用现代生物学手段通过遗传转化表达特定基因已经成为快速高效获得优质种质资源的重要途径。影响植物生长的基因成为该过程的重中之重。将假俭草生长素运输相关基因eobr2用农杆菌介导的遗传转化方法转化水稻，获得了株高变高，根系变长的新资源，对于培育新型优良假俭草种质资源具有重要意义。

4、参考文献：

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技术实现思路

1、本发明的目的在于针对实际生产中假俭草成坪较慢的问题，提供一个新的生长素极性运输相关基因eobr2，该基因的序列为seq id no.1。

2、本发明的另一目的在于提供一种eobr2基因植物表达载体及其应用。构建eobr2基因的植物表达载体可确定eobr2的促进植物株高和根系生长，为植物种质改良提供优异的基因。

3、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

4、假俭草促生长基因eobr2，该基因是生长素极性运输相关基因，该基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、含有上述假俭草促生长基因eobr2的生物材料，该生物材料为重组载体、表达盒、转基因细胞系或转基因重组菌。

6、作为一种优选技术方案，所述的重组载体为重组表达载体，该重组表达载体是将上述的假俭草促生长基因eobr2转入植物表达载体得到的。优选的，所述的重组表达载体为将带有pcambia1305.2m同源臂的eobr2基因片段与酶切过的pcambia1305.2m表达载体进行同源重组反应得到。所述的pcambia1305.2m改造自市售的pcambia1305.2，将pcambia1305.2 gus基因上游的35s启动子替换为玉米ubiquitin启动子，即可获得pcambia1305.2m，该载体购自南京易佰斯生物科技有限公司。

7、一种假俭草促生长基因eobr2植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：

8、(1)假俭草促生长基因eobr2的克隆

9、以‘赣北’假俭草为材料，提取叶片的总rna，反转录为cdna，设计引物扩增eobr2基因，

10、上游引物eobr2-f：5′-atgctcgtcggcaccctc-3′(seq id no.2)，

11、下游引物eobr2-r：5′-cgccgcggccccgttggat-3′(seq id no.3)，

12、以反转录的cdna为模板，以eobr2-f和eobr2-r为引物，进行pcr反应，将pcr产物连接到pce2-t载体，转化dh5α感受态细胞，提取阳性质粒pce2-eobr2，测定序列为seq idno.1；

13、(2)植物表达载体pcambia1305.2m-eobr2的构建

14、设计引物以上述(1)中测序正确的阳性质粒pce2-eobr2为模板，在eobr2基因的上下游分别引入pcambia1305.2m ecor i和hind iii位点处的同源臂，

15、上游引物eobr2-ecori-f：5′-acctctagacccggggaattcatgctcgtcggcaccctc-3′，(seq id no.4)，

16、下游引物eobr2-hind iii-r：5′-cttgtcgacactagtaagcttcgccgcggccccgttggat-3′，(seq id no.5)；

17、以提取的阳性质粒pce2-eobr2为模板，进行pcr扩增；将pcr产物经过胶回收后，与经ecor i和hind iii酶切并回收纯化的pcambia1305.2m线性化载体进行同源重组反应，重组产物转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，经pcr鉴定单克隆后，提取阳性质粒，并测序验证为seq id no.1，植物表达载体pcambia1305.2m-eobr2构建成功。

18、(3)采用农杆菌介导法将步骤(2)获得的pcambia1305.2m-eobr2植物表达载体导入水稻，经过潮霉素抗性筛选得到阳性转化植株，对阳性转化植株进行qpcr检测验证外源基因已经成功插入转基因植株的基因组发生转录及其表达量的升高；获得生长更旺盛的转基因水稻植株。

19、所述的对阳性转化植株进行qpcr检测的过程为：

20、取潮霉素抗性筛选得到的阳性转化植株嫩叶及未转化植株嫩叶，提取总rna，并反转录成cdna，在相邻两个外显子上分别设计上下游引物，片段长为202bp，引物序列为：

21、上游引物eobr2-q6f：5′-ttcatcatcaagctccccga-3′(seq id no.6)，

22、下游引物eobr2-q6r：5′-cgatcatgaagcggtccag-3′(seq id no.7)。

23、分别以阳性转化植株和未转化植株cdna为模板，以eobr2-q6f和eobr2-q6r为引物，进行qpcr检测，并分析其表达量变化；

24、以水稻osubiquitin扩增的基因片段为内标，片段长度为117bp，引物序列：

25、上游引物ubq-f：5′-gctccgtggcggtatcat-3′(seq id no.8)，

26、下游引物ubq-r：5′-cggcagttgacagccctag-3′(seq id no.9)。

27、本发明所述的技术方案利用根癌农杆菌介导法，将eobr2基因导入水稻，并经过潮霉素筛选愈伤组织；抗性愈伤组织分化得到阳性转化植株，对植株进行qpcr检测验证外源基因已经转入转基因植株的基因组dna中发生转录且表达量提高，并对转基因植株后代进行表型观察，确定假俭草eobr2基因促进植物生长的功能。

28、采用农杆菌介导法将eobr2基因导入水稻中，进行培养获得转基因植株的详细过程为：

29、取10μl步骤(2)获得的pcambia1305.2m-eobr2植物表达载体加入100μl农杆菌感受态eha105，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800μl yeb液体培养基，28℃200rpm预培养4h，涂布于yeb(50μg/ml利福平+50μg/ml卡那霉素)平板，28℃培养约24h-36h。从平板上挑取eha105单菌落，并pcr检测出阳性菌落，pcr体系10μl：2×rapid taq master mix5μl，上游引物eobr2-kzf 0.3μl，下游引物eobr2-kzr 0.3μl，ddh2o 4.4μl，用灭菌枪头挑取少许菌斑于上述pcr体系中吹打混匀；反应程序：95℃预变性3min，然后95℃解链15sec，60℃退火15sec，72℃延伸20sec，反应35个循环，72℃延伸5min；产物大小约434bp，pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测(图3)，阳性克隆供后续转化水稻愈伤组织。水稻转化由百格生物技术有限公司完成。

30、选择抗性愈伤组织分化出的植株，经练苗7天后转入土中栽培，取转化植株及野生型植株新鲜叶片提取总rna，反转录成cdna，在相邻两个外显子上分别设计上下游引物，片段长为202bp，引物序列为：

31、上游引物eobr2-q6f：5′-ttcatcatcaagctccccga-3′(seq id no.6)，

32、下游引物eobr2-q6r：5′-cgatcatgaagcggtccag-3′(seq id no.7)。

33、分别以阳性转化植株和未转化植株cdna为模板，以eobr2-q6f和eobr2-q6r为引物，进行qpcr检测，并分析其表达量变化；

34、以水稻osubiquitin扩增的基因片段为内标，片段长度为117bp，引物序列：

35、上游引物ubq-f：5′-gctccgtggcggtatcat-3′(seq id no.8)，

36、下游引物ubq-r：5′-cggcagttgacagccctag-3′(seq id no.9)。

37、长大的阳性植株收取种子。将野生型种子和阳性植株收取的种子，浸种发芽，并进行单株pcr鉴定出阳性植株，然后转移至营养液水培25天左右，观察植株地上部和地下部根系生长情况，发现相对于野生型水稻，转基因水稻株高和根系显著伸长(图4图5图6)。

38、假俭草促生长基因eobr2在提高植物生长能力或培育较强生长能力的新种质中的应用也属于本发明的保护范围。

39、含有上述假俭草促生长基因eobr2的生物材料在提高植物生长能力或培育较强生长能力的新种质中的应用。

40、上述的应用，在目标植物中过表达上述的假俭草促生长基因eobr2。

41、本发明研究过程中，将eobr2基因植物表达载体导入水稻，促进水稻植株生长，确定eobr2的具有促进植物生长的功能，可用于假俭草种质改良。

42、本发明所提供的假俭草促生长基因eobr2及其植物表达载体和应用具有如下优点:

43、本发明筛选了一种假俭草促生长基因eobr2，该基因是生长素极性运输相关基因，构建含有促生长的eobr2基因的植物表达载体pcambia1305.2m-eobr2，导入植物中，促进植物生长。为假俭草草坪建植过程中生长缓慢的问题提供了有效的解决方法和思路和潜在利用基因。