一种基于双荧光标记探针检测尼罗罗非鱼等位基因表达量的方法

本发明涉及检测尼罗罗非鱼等位基因表达量，具体为一种基于双荧光标记探针检测尼罗罗非鱼等位基因表达量的方法。

背景技术：

1、目前自然界中已知的鱼类约有32700种，分属57目，482科，4258属，是脊椎动物中分布最广，种类最多的类群，具有多种多样的生物学特性和重大的经济价值。作为较低等的脊椎动物，鱼类在动物系统进化中处于承前启后的关键地位，有着长久的进化历史和繁多演化分枝，并在进化过程中表现出各种趋同性、趋异性和保守性，变化纷繁，物种进化异常活跃。由于鱼类在脊椎动物中的特殊进化地位、庞大的种类数量以及显著的社会经济价值，鱼类的性别决定研究一直受到遗传学家和发育学者的重视。

2、一般而言，脊椎动物的性别决定和性别分化主要有遗传性别决定和环境性别决定两种模式。遗传性别决定一般都是由性别决定基因启动一系列性别相关基因参与的信号传递网络，并诱导原始性腺发育成为精巢或卵巢的过程。现有研究表明，脊椎动物性别决定信号传递网络中的下游基因相对保守，但是处于最上游的性别决定基因却存在多样性，其中哺乳类和鸟类相对保守，分别为sry和dmrt1，两栖类只确定非洲爪蟾一种动物，为dm-w，鱼类中已知确定的性别决定基因已多达10种，包括日本青鳉(oryz ias l at i pes)dmy、虹鳟(oncorhynchus myki ss)sdy、恒河青鳉(oryz ias dancena)sox3，红鳍东方鲀(takifugu rubr ipes)amhr i i、尼罗罗非鱼(oreochromi s n i l ot icus)和银汉鱼(atheri na b l eeker i)amhy、吕宋青鳉(oryz ias l uzonens i s)和裸盖鱼(anop l opoma fimbr ia)gsdf、非洲齿鲤(nothobranch i us furzer)gdf6y、大西洋鳕鱼(gadus morhua)zky[16]、斑点叉尾鮰(i cta l urus punctatus)bcar1、半滑舌鳎(cynogl ossus semi laevi s)dmrt1。

3、尼罗罗非鱼性别决定基因amhy是由amh在y染色体上串接复制而来，与x染色体上的amh相比编码区有一个碱基的不同(393c/t)，导致编码的氨基酸由丝氨酸变成亮氨酸，且启动子区域有大片段的删除和插入，正是这些改变使其成为尼罗罗非鱼的雄性性别决定基因。通过crispr/cas9在尼罗罗非鱼xy个体敲除amhy后，导致xy性逆转，发育为卵巢，同时在缺失xy性腺中检测到xx性腺特异表达的雌激素合成关键酶芳香化酶cyp19a l a的表达和血清雌激素(e2)的上调。相反，没有检测到雄性精巢serto l i细胞特异标记dmrt1的表达。由于amhy与amh基因序列仅有一个碱基的差异，其表达量的检测是难点，无法采用常规的荧光定量pcr对进行检测，而利用组学的方法虽然能准确检测表达量，但由于价格昂贵，不适宜进行大批量样品检测。因此，需要建立一种快速、准确、低价的amhy等位基因表达量的方法，为尼罗罗非鱼性别决定机制研究提供基础。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于双荧光标记探针检测尼罗罗非鱼等位基因表达量的方法，解决了现有的检测方法价格昂贵，并且检测效率较低的问题。

3、(二)技术方案

4、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种基于双荧光标记探针检测尼罗罗非鱼等位基因表达量的方法，具体包括以下步骤：

5、s1.标准品制备

6、取尼罗罗非鱼遗传雌鱼肌肉组织保存于-20℃冰箱，并利用tianamp mar i ne anima l s dna k it试剂盒提取肌肉基因组dna，nanodrop2000超微量分光光度计测量dna的浓度和od260/od280比值，1.0％琼脂糖电泳检测dna的完整性，将提取的dna基因组保存于-20℃冰箱；

7、s2.标准曲线制作

8、根据amh-c和amh-t基因序列，设计双荧光标记探针引物，easy di l ut ion将构建的dna标准品amh-c和amh-t分别进行梯度稀释(5x105、5x104、5x103、5x102、5x101、5x100cop ies/μl)作为模板进行qrt-pcr扩增，制作dna标准曲线；

9、s3.引物特异性验证

10、为验证amh-t和amh-c探针引物的特异性，取t样品(5x105 copies/μl)和c样品(5x103 cop ies/μl)各1μl，加入到98μl easy di l ut ion中，制备amht/amhc混合样品(t/c混合样品)，其中amht浓度为5x105 copies/μl，amhc浓度为5x103cop ies/μl。以t样品(5x105copies/μl)和amht/amhc混合样品为模板，利用amh-t探针引物进行rt-qpcr扩增；以c样品(5x103cop i es/μl)和amht/amhc混合样品为模板，利用amh-c探针引物进行rt-qpcr扩增，并设两个阴性对照；

11、s4.结果与分析

12、进行amh-c标准曲线构建、amh-t标准曲线构建和amh-t/c引物特异性验证。

13、优选的，所述步骤s1中amh基因在尼罗罗非鱼遗传雌鱼表现为纯合型(amht/amht)，直接利用雌鱼基因组dna制备amh-t标准品。

14、优选的，所述步骤s1中由于amh基因在尼罗罗非鱼遗传雄鱼表现为杂合型(amht/amhc)，无法获得纯合amhc基因序列，因此利用基因合成的方法，参考amht基因序列合成211bp的amhc基因，并将片段插入到pmd-19t载体中，并进行线性化处理，构建amh-c标准品。

15、优选的，所述步骤s4中amh-c标准曲线构建详细的为在5x100copies/μl～5x105copies/μl的浓度区间内,所得拷贝数(x)与ct值(y)的线性方程为y＝﹣3.284*㏒(x)﹢35.69。amh-c标准曲线平均斜率为-3.284,p平均截距为35.69，相关系数均大于0.995，qpcr反应体系的扩增效率接近理想水平。

16、优选的，所述步骤s4中amh-t标准曲线构建详细的为在5x100copies/μl～5x105copi es/μl的浓度区间内，所得拷贝数(x)与ct值(y)de线性方程为y＝﹣3.674*㏒(x)+43.67。amh-c标准曲线平均斜率为﹣3.674,p平均截距为43.67，相关系数均大于0.995，qpcr反应体系的扩增效率接近理想水平。

17、优选的，所述步骤s4中amh-t/c引物特异性验证详细的为将amh-c、amh-t探针引物分别加入t样品、c样品、c/t混合样品中，amh-t探针引物在浓度相同amht的t样品、c/t混合样品中ct值没有显著差异，amh-c探针引物在浓度相同amhc的c样品、c/t混合样品中ct值没有显著差异。

18、(三)有益效果

19、本发明提供了一种基于双荧光标记探针检测尼罗罗非鱼等位基因表达量的方法。具备以下有益效果：

20、本发明提供了一种基于双荧光标记探针检测尼罗罗非鱼等位基因表达量的方法，等位基因性别决定是继主效基因性别决定和计量效应性别决定之后在脊椎动物发现的第三种遗传性别决定模式，尼罗罗非鱼性别决定基因amhy是由amh在y染色体上串接复制而来，与x染色体上的amh相比编码区有一个碱基的不同(393c/t)，由于amhy基因与amh基因只有一个碱基差异，其表达量的检测是难点，无法采用常规的荧光定量pcr对其进行精准区分并检测，因此，本发明建立一种双荧光标记探针(amh-c/amh-t)检测尼罗罗非鱼amhy等位基因表达量的方法，结果表明，amh-c和amh-t探针引物所建立的标准曲线的线性相关系数r2均为0.999，具有良好的线性关系，并且验证试验表明，两个探针引物具有良好的特异性，可用于尼罗罗非鱼amhy基因和amh基因的精准定量检测，为进一步研究尼罗罗非鱼性别决定机制提供了基础。