一种分离和纯化外泌体的方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种分离和纯化外泌体的方法。

背景技术：

1、外泌体是一种直径为30～150nm具有脂质双层膜结构的囊性小泡，由各种活细胞通过内吞-融合-外排等一系列生物学机制产生。外泌体中含有一些重要的生物活性分子，如蛋白质、脂质、dna、rna、mrna、mirna等，在细胞间通讯交流以及生理和病理的发生发展起着重要作用。此外，外泌体还是一种新型药物运载工具，有着避免免疫排斥反应和靶向性较强的优点。目前国内外的外泌体分离纯化方法多以超速离心法为主，此外还有聚合沉淀法、免疫分离法、超滤法以及尺寸排阻色谱法。

2、超速离心法，也称差速离心法，是目前外泌体分离提取的金标准，该方法主要包括三步：(1)低速离心力(约<2000×g)去除细胞和细胞碎片；(2)增大离心力(约10000～20000×g)去除大囊泡；(3)超高速离心(约100000×g)获得样本中的外泌体。为提高纯度还可选用蔗糖密度梯度离心，即在超速离心法的基础上，加入分离介质如蔗糖和碘克沙醇等，使其在溶液中停留在不同梯度层，从而分离外泌体。然而超速离心法提取外泌体具有外泌体回收率低、设备昂贵(一般中小实验室难以配备)的缺点。

3、聚合沉淀法是利用膜的疏水性和相关水溶性化合物竞争性结合水分子，用于共沉淀疏水蛋白和脂质分子。可大批量分离、外泌体产量高，但是共沉淀蛋白杂质多，产品纯度低。免疫分离法是外泌体表面带有特殊的膜蛋白，与固载与不同基质上的同源抗体特异性结合，进而实现外泌体的分离。但是，该方法试剂成本高、获得的外泌体仅为标志物阳性的外泌体亚群而不是全部外泌体。

4、超滤法是在一定的外界推动力(压力)作用下，使液体中大于膜孔的颗粒和分子量较高的物质由于分子筛作用被截留，而水和小溶质颗粒则透过孔径被分离，已有相关商品销售，如bioosciencetific的exomir试剂盒。然而该方法的缺点是：分离效率低、压力推动可能导致外泌体破碎变型、需要特殊装置价格昂贵。

5、排阻色谱法是一种根据分子的尺寸进行分离的色谱技术，其提取缺点是：需特殊装置，价格昂贵；只能小批量分离，如凝胶色谱柱一般要求上样量在0.5ml以内，且无法同时对多个样本进行处理

6、综上所述，目前尚无价格低廉、提取纯化程度高、提取产量大、能大批量分离、能批量处理多个样本的外泌体分离纯化方法。

7、此外，有研究证明直接注射外泌体可从血液循环中快速清除，并在肝、脾、肺和胃肠道中聚集，半衰期小于5分钟，生物利用度低，例如：文献(1)takahashi y,nishikawa m,shinotsuka h,matsui y,ohara s,imai t,takakura y.

8、visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanomab16-bl6cells in mice after intravenous injection.j biotechnol.2013may 20；165(2):77-84.doi:10.1016/j.jbiotec.2013.03.013.epub 2013apr 2.pmid:23562828.的研究。文献(2)charoenviriyakul c,takahashi y,morishita m,matsumoto a,nishikawa m,takakura y.cell type-specific and common characteristics of exosomes derivedfrommouse cell lines:yield,physicochemical properties,andpharmacokinetics.eur jpharm sci.2017jan 1；96:316-322.doi:10.1016/j.ejps.2016.10.009.epub 2016oct 5.pmid:27720897.的研究。

9、因此，外泌体的产率低、纯度低、分离成本高及半衰期短等问题共同限制了外泌体临床研究的发展和大规模应用。

技术实现思路

1、为了解决外泌体分离纯化效率低，设备试剂成本高，以及在体内半衰期短，生物利用度低的难题。本发明提供了一种分离和纯化外泌体的方法，该方法无需超速离心机等价格高昂的设备，价格低廉，操作简单，一次操作可分离纯化多个样本，所提取外泌体回收率高，纯度高，生物利用度高，能满足大规模应用的需求。

2、为实现上述目的，本发明提供一种分离和纯化外泌体的方法，包括以下步骤：

3、s1.将细胞上清液在温度为4℃的条件下低速离心25～35min，留取上清液，弃去沉淀；

4、该低速离心步骤用于除去细胞、死细胞等杂质。

5、s2.将步骤s1得到的上清液在温度为4℃的条件下高速离心0.8～1.2h，留取上清液，弃去沉淀；

6、该高速离心步骤用于除去细胞碎片等杂质。

7、s3.将步骤s2得到的上清液用0.2μm无菌过滤器进行过滤处理，得过滤液；

8、该过滤处理步骤用于除去细菌、大囊泡等杂质。

9、s4.将步骤s3得到的过滤液与peg6000充分混合，在温度为4℃的条件下沉降过夜，然后在温度为4℃的条件下低速离心0.8～1.2h，留取沉淀，弃去上清；

10、该初次纯化步骤用于除去小分子蛋白，氨基酸等杂质，浓缩、纯化外泌体。

11、s5.将步骤s4得到的沉淀用pbs重悬，加入蛋白酶孵育，充分混匀，在温度为30～60℃的条件下孵育，得孵育产物；

12、该再次纯化步骤用于消化步骤s4共沉降下来的其他蛋白杂质。

13、s6.将步骤s5得到的孵育产物与peg6000充分混合，在温度为4℃的条件下沉降过夜，然后在温度为4℃的条件下低速离心0.8～1.2h，留取沉淀，弃去上清，并在温度为-80℃的条件下低温保存，即得。

14、该加强纯化步骤用于除去蛋白杂质和步骤s5消化后产生的氨基酸、多肽等杂质，进一步提升外泌体纯度。

15、进一步地，所述步骤s1、步骤s4和步骤s6中的低速离心的速度为2000～5000g。

16、进一步地，所述步骤s2中的高速离心的速度为6000～12000g。

17、进一步地，所述步骤s4中的peg6000的终浓度为10％～20％(m/v)。

18、进一步地，所述步骤s5中的蛋白酶为蛋白酶k。

19、进一步地，所述步骤s5中加入蛋白酶使其终浓度为0.01mg/ml～1.0mg/ml。

20、进一步地，所述步骤s5中加入蛋白酶在30～60℃孵育0.2h～10h。

21、进一步地，所述步骤s6中的peg6000的终浓度为3％～10％(m/v)。

22、蛋白酶是能够水解蛋白质中肽键结构，产生氨基酸或多肽的一类酶的总称，蛋白质可通过蛋白酶的酶切、特异性进行酶解生成有特定活性的肽类物质。酶水解法反应条件温和，避免了化学水解法中的比较极端的反应条件，具有所得酶解产物含盐量低、无氨基酸破坏和消旋现象、无毒副产物、对环境无污染等优点。

23、发明人首次提出将蛋白酶k用于外泌体的孵育，使制得的外泌体半衰期延长，提高外泌体的生物利用度。具体地，本发明通过先离心和过滤，除去了外泌体中的细胞、细胞碎片、大囊泡等杂质，然后通过加入peg6000过夜处理，可以有效去除外泌体中混合的大部分杂质蛋白，再通过加入蛋白酶孵育，该步骤可有效除去剩余的大部分杂质蛋白，同时蛋白酶可以自我消化，而外泌体耐消化，不会降低外泌体产率，最后再次进行peg6000处理，除去消化后产生的多肽、氨基酸和残留的蛋白酶等杂质，进一步提升外泌体纯度。同时经蛋白酶孵育的外泌体，其半衰期被延长，被肺部的吸收减少，大大地提高了外泌体的生物利用度。

24、与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

25、(1)成本低：本发明只需配备一台小型离心机，无需其他昂贵设备和特殊装置，而且所用试剂耗材成本低，无需其他价格昂贵的试剂耗材；

26、(2)处理量大：本发明能同时处理多个样本，如实验室常用的小型桌面离心机配备的转子能同时完成多达24个样本的提取，操作简单快速，可大批量分离；

27、(3)产物质量高：本发明方法能够获得外泌体的全部亚群，而不取决于抗体特异性，获得的外泌体纯度高、产率高，其半衰期有所延长，有效解决了外泌体半衰期短，生物利用度低的问题。

28、综上所述，本发明提供的分离和纯化外泌体的方法具有操作简单，处理量大，成本低廉的优点，同时采用该分离和纯化外泌体的方法制得的外泌体纯度高、产率大、半衰期长和生物利用度高的优点，是一种较为理想的外泌体分离纯化方法。