PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法与流程

本发明属于分子生物学，具体涉及一种prcv、prrsv、siv和prv的多重rt-qpcr试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、猪呼吸道冠状病毒(porcine respiratory coronavirus，prcv)具有约28.5 kb的单股正链rna基因组，是猪传染性胃肠炎病毒（tgev）的一种自然变异株，与tgev相比，prcv基因组在s基因n端有621-681 nt的缺失，产生一个更小的s蛋白，同时s基因下游orf3也有缺失，这些遗传变化可能解释了prcv组织向性的改变(从肠道到呼吸道)。prcv感染通常是亚临床或轻微的，但当与其他病毒或细菌合并感染时，可引起严重的呼吸道疾病，造成更多的经济损失。

2、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproduc-tive and respiratory syndromevirus，prrsv)是动脉病毒科的一种正链rna病毒，该病毒在肺中复制，感染后引起猪只高热、咳嗽、呼吸困难等症状，是全世界猪生产损失的主要原因，给养猪业造成严重的经济损失。

3、猪流感病毒（swine influenza virus，siv）属于单股负链rna病毒，其基因组的大小约为13.6 kb，由8个独立的片段组成，大小不一，目前世界范围内流行的siv主要是h1n1、h1n2和h3n2三种亚型。猪流感在世界各地均有报道，造成猪群生产损失，因此，有必要加强更广泛的猪流感监测。

4、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，prv)是疱疹病毒科的一员，是一种线性dna分子。prv在猪身上是一种高度传染性和致命的病原体，引起猪只体温升高、呼吸系统障碍等症状，同时导致新生仔猪神经症状，怀孕母猪流产，公猪睾丸肿胀、萎缩等症状，其传染性强，在养猪业中死亡率高。

5、国内外已有多种针对prcv、prrsv、siv与prv进行单一或两种病原体同时检测建立的pcr检测方法，但是目前尚未报道有能够同时检测prcv、prrsv、siv和prv的qpcr方法，实时定量聚合酶链式反应（real-time qpcr）在目标基因组的定量和检测方面具有很大的优势，具有特异性高、灵敏度好和可重复性强，不受人为因素干扰，通过计算机和分析软件实现pcr扩增、产物检测和定量分析一体化，可保障实验场所安全、无污染等优点，因此建立可同时、快速检测这4种病原体的qpcr方法可为实验室检测提供有力的技术手段。

技术实现思路

1、针对上述不足，本发明公开了一种prcv、prrsv、siv和prv的多重rt-qpcr试剂盒及检测方法，其具有特异性好、灵敏度高的优点，能够同时检测猪呼吸道冠状病毒（prcv）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）、猪流感病毒（siv）和猪伪狂犬病毒（prv），为实验室快速、准确的检测区分上述病毒株提供了有效的技术手段。

2、本发明是采用如下技术方案实现的：

3、一种prcv、prrsv、siv和prv的多重rt-qpcr试剂盒，其包括以下引物和探针：

4、引物f1的序列如序列表seq id no.1所示为ctggggytgaagtcga；

5、引物r1的序列如序列表seq id no.2所示为ggtcatctttagcagatact；

6、探针a的序列如序列表seq id no.3所示为

7、vic-tctgaaggtgctgaagggatttctt-bhq1；

8、引物f2的序列如序列表seq id no.4所示为gccagatgctgggtaagat；

9、引物r2的序列如序列表seq id no.5所示为catcttcagtcgctagaggaaa；

10、探针b的序列如序列表seq id no.6所示为

11、fam-aaaccagtccagaggcaagggac-bhq1；

12、引物f3的序列如序列表seq id no.7所示为tgggatcttgcacctgatattg；

13、引物r3的序列如序列表seq id no.8所示为cactctgctgttcctgttgat；

14、探针c的序列如序列表seq id no.9所示为

15、texas red-tacggaaggagtgcctgagtccat-bhq2；

16、引物f4的序列如序列表seq id no.10所示为gaggccctggaagaagttg；

17、引物r4的序列如序列表seq id no.11所示为tcctggactacagcgagat；

18、探针d的序列如序列表seq id no.12所示为

19、cy5-cgatgtcgtagaacttgagcgcgt-bhq3。

20、所述引物f1、引物r1和探针a是用于检测prcv中的orf1基因；

21、所述引物f2、引物r2和探针b是用于检测prrsv中的n基因；

22、所述引物f3、引物r3和探针c是用于检测siv中的m基因；

23、所述引物f4、引物r4和探针d是用于检测prv中的gb基因。

24、一种prcv、prrsv、siv和prv的多重rt-qpcr的检测方法，用于非疾病诊断和治疗目的，其包括以下步骤：

25、（1）样品处理：采用rna/dna提取试剂盒对待测样品进行总rna/dna的提取，得到总rna/dna；所述待测样品包括猪的鼻咽拭子和口咽拭子以及猪的组织样品中的任意一种或多种样品；

26、（2）扩增反应液配制：将步骤（1）中得到的总rna/dna作为模板进行qpcr扩增反应，采用如序列表seq id no.1～no.12所示的引物和探针配制扩增反应液，所述扩增反应液总体积为25μl，其包括：12.5µl的2× one-step pcr buffer，0.5µl ex taq hs(takara)，0.5µl primerscript rt enzyme mix，2.5µl的模板，引物f1和引物r1各0.3µl，0.1μl的探针a，引物f2和引物r2各0.3µl，0.2μl的探针b，引物f3和引物r3各0.2µl，0.2μl的探针c，引物f4和引物r4各0.3µl，0.2μl的探针d，余量为无核酸酶水；

27、（3）qpcr扩增：将步骤（2）中配制得到的扩增反应液在荧光定量pcr仪中依次进行如下扩增反应程序：

28、step1：42℃反转录5 min；

29、step2：95℃预变性10 s；

30、step3：95℃变性5s，57℃退火34s，共进行40个循环，同时收集荧光信号；

31、（4）结果检测：通过荧光定量pcr仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的ct值并进行结果判定。

32、进一步的，步骤（1）中，所述的猪的组织样品包括猪的肺脏、气管、淋巴结、肝脏、肾脏、脾脏中的任意一种或多种。

33、进一步的，在步骤（1）中，当所述待测样品为猪的肺脏、气管、淋巴结、肝脏、肾脏、脾脏中任意一种或多种组织样品时，将其加入搅拌器中，再加入ph为7.2的磷酸盐缓冲溶液（pbs）搅拌均匀得到混合物，取混合物并加入小钢珠摇动5分钟得到均质化的样品，接着将均质化的样品反复冻融3次，接着在4℃下以10000×g的条件离心10分钟，然后取上清液进行总rna/dna的提取；当所述待测样品为猪的鼻咽拭子或口咽拭子时，将其在试管中用1.0ml ph为7.2的pbs溶液稀释，接着涡旋30秒，并在4℃下以10000×g的条件离心10分钟，然后取上清液提取总rna/dna。

34、进一步的，步骤（2）中，所述引物f1、引物r1、引物f2、引物r2、引物f3、引物r3、引物f4、引物r4、探针a、探针b、探针c和探针d的浓度均为25 pmol/μl。

35、进一步的，在步骤（4）中，当所得到的ct值小于等于35个周期时，判定为阳性，当ct值大于35个周期时，判定为阴性。

36、本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：

37、prcv、prrsv、siv与prv的表现存在一定的相似，使得它们很难被区分。同时，国内外目前尚无同时、快速检测并鉴别prcv、prrsv、siv与prv的方法，所以本发明针对prcvorf1基因、prrsv n基因、siv m基因和prv gb基因设计了四对特异性引物和相应的探针，并开发了一种基于taqman探针的多重rt-qpcr检测方法，其能够同时检测prcv、prrsv、siv和prv毒株，并且本发明检测方法的检测下限为15 copies/μl，可以特异性检测prcv 、prrsv、siv 和prv，与其他猪病毒无交叉反应，由此可见，本发明方法具有快速、特异、灵敏、准确的优点，可方便地用于猪呼吸道冠状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流感病毒和猪伪狂犬病毒病原体的定性定量检测，为实验室检测区分这4种病毒株提供了有效的技术手段。