检测人TPMT基因和NUDT15基因多态性的组合物、试剂盒及方法与流程

本发明涉及基因检测，特别涉及检测人tpmt基因和nudt15基因多态性的组合物、试剂盒及方法。

背景技术：

1、巯嘌呤类药物如6-巯基嘌呤(mercaptopurine，6-mp)、6-硫鸟嘌呤(thioguanine，6-tg)和硫唑嘌呤(azathioprine，azp)等是一类具有免疫抑制作用的抗代谢药；6-tg和6-mp常用于恶性肿瘤的化疗，azp则主要用于自身免疫性疾病及器官移植患者；硫嘌呤甲基转移酶(tpmt)活性表现出单基因共性遗传并分解代谢硫嘌呤；tpmt等位基因变异与酶活性低和硫嘌呤的明显药理作用有关。nudt15基因中导致其功能丧失的等位基因在亚洲人和西班牙裔中很常见，其可降低活性硫嘌呤核苷酸代谢产物的降解；

2、巯嘌呤甲基转移酶(thiopurines-methyltransferase，tpmt)是一种催化巯嘌呤类药物如6-巯嘌呤(6-mercatopurine，6-mp)硫代甲基化的胞浆酶；在体内6-mp代谢为硫鸟嘌呤核苷酸(6-tgn)掺入dna而发挥细胞毒效应，但通过tpmt甲基化可生成无活性的代谢产物；tpmt活性与6-mp的疗效和毒性反应相关，tpmt的遗传多态性与嘌呤类药物的疗效和毒性有关，人体tpmt活性呈三态分布，约90％的个体为tpmt野生型的高酶活性者；10％的个体为tpmt杂合子变异者，表现出中等酶活性；0.3％的个体为tpmt纯合子变异者，导致tpmt活性低或无活性；tpmt杂合子变异者可耐受65％的6-mp标准剂量，纯合突变者仅能耐受5％～10％的标准剂量。现已发现20余种tpmt基因突变，其中tpmt*2、tpmt*3最为常见，占中等酶活性和低酶活性个体的90％以上；活性高的患者长期服用巯嘌呤类药物易产生耐受性，可能增加复发率；活性低的患者即使使用常规剂量的硫嘌呤类药物，也会增加发生严重的血液学不良反应的风险，甚至会导致患者死亡；fda已批准在6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤和硫唑嘌呤的药品说明书中增加在用药前进行tpmt基因多态性检测的建议；

3、核苷二磷酸链接部分x型结构域基因15(nudt15)基因编码的水解酶能使硫唑嘌呤的活性代谢物6-tgtp和6-tgdp去磷酸化而减少毒性，是硫嘌呤活化和毒性的负调节剂；nudt15基因的突变导致硫嘌呤的代谢不良，并且与硫嘌呤诱导的早期白细胞减少有关；尽管目前尚缺乏多民族研究来检验这两种tpmt和nudt15变体，实际上，tpmt与nudt15活性降低功能的携带者对硫嘌呤的耐受程度(例如巯基嘌呤)在很大程度上相似；因此，cpic对nudt15多态性检测的建议与tpmt相似；对于nudt15正常代谢者(nudt15*1/*1)，无需更改起始剂量；对于nudt15中间代谢物(nudt15*1/*3)，应考虑减少起始剂量以尽量减少毒性，对于nudt15弱代谢者(nudt15*3/*3)应降低用药剂量大幅或考虑使用替代药物，为此，提出检测人tpmt基因和nudt15基因多态性的组合物、试剂盒及方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明希望提供检测人tpmt基因和nudt15基因多态性的组合物、试剂盒及方法，以解决或缓解现有技术中存在的技术问题，至少提供一种有益的选择。

2、本发明实施例的技术方案是这样实现的：检测人tpmt基因和nudt15基因多态性的组合物，所述组合物包括：

3、①、如seq id no:1所示的tpmt基因238上游引物、如seq id no:2所示的tpmt基因238下游引物、如seq id no:3所示的tpmt基因238的探针和seq id no:4所示的tpmt基因238的探针；

4、②、如seq id no:5所示的tpmt基因460上游引物、如seq id no:6所示的tpmt基因460下游引物和如seq id no:7和seq id no:8所示的tpmt基因460的探针；

5、③、如seq id no:9所示的tpmt基因719上游引物、如seq id no:10所示的tpmt基因719下游引物和如seq id no:11和seq id no:12所示的tpmt基因719的探针；

6、④、如seq id no:13所示的nudt15基因415上游引物、如seq id no:14所示的nudt15基因415下游引物和如seq id no:15和seq id no:16所示的nudt15基因415的探针。

7、进一步优选的，所述组合物为①-④以任意两两组合的形式存在，具体组合的形式为：

8、表现形式一：①和②为一组，③和④为另一组；

9、表现形式二：①和③为一组，②和④为另一组；

10、表现形式三：①和④为一组，②和③为另一组；

11、所述一组内的4种探针的荧光报告基团彼此互不相同，并且另一组内的4种探针的荧光报告基团彼此互不相同，第一组和第二组以单独包装的形式存在。

12、进一步优选的，如seq id no:3所示的tpmt基因238的探针的荧光报告基团为fam；如seq id no:4所示的tpmt基因238的探针的荧光报告基团为hex；如seq id no:7所示的tpmt基因460的探针的荧光报告基团为rox；如seq idno:8所示的tpmt基因460的探针的荧光报告基团为cy5。

13、进一步优选的，如seq id no:11所示的tpmt基因719的探针的荧光报告基团为fam；如seq id no:12所示的tpmt基因719的探针的荧光报告基团为hex；如seq id no:15所示的nudt15基因415的探针的荧光报告基团为rox；如seq id no:16所示的nudt15基因415的探针的荧光报告基团为cy5。

14、进一步优选的，所述组合物中引物的用量为0.2～0.4μmol/l；所述组合物中探针的用量为0.2～0.4μmol/l。

15、检测人tpmt基因和nudt15基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括组合物，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dntp、dna聚合酶、pcr缓冲液中的至少一种；

16、dntp的浓度为2～3mmol/l，pcr缓冲液为3～7μl；

17、pcr反应缓冲液包括ph7.5的200mmol/l三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/l氯化镁溶液、500mmol/l氯化钾溶液、0.2％(体积/体积)曲拉通溶液和10％(体积/体积)甲酰胺溶液。

18、进一步优选的，所述试剂盒还可以包括mg2+、糖基化酶、dutp；

19、所述dna聚合酶为5u/μl～15u/μl；所述糖基化酶为0.05u/μl～0.2u/μl；

20、通过设置尿嘧啶dna糖基化酶(ung酶)+dutp防污染体系，利用ung酶将可能存在的pcr产物污染充分降解，以排除由此可能引起的假阳性结果，使检测结果更准确。

21、进一步优选的，所述试剂盒还具有阴性对照和阳性对照。

22、检测人tpmt基因和nudt15基因多态性的方法，包括以下步骤：

23、s1、释放待测样本的核酸；

24、s2、使用如权利要求书1-5中任一所述的组合物或权利要求书6-8中所述的试剂盒对步骤，获得的核酸进行荧光定量pcr；

25、s3、获得并分析结果。

26、进一步优选的，在所述s2中，所述荧光定量pcr的反应条件由反应体系和扩增程序组成。

27、本发明实施例由于采用以上技术方案，其具有以下优点：

28、一、本发明的组合物能够检测人tpmt基因和nudt15基因的多态性，特别地，能够检测tpmt基因rs1800462(238g＞c)位点、rs1800460(460g＞a)位点、rs1142345(719a>g)位点和nudt15基因rs116855232位点(415c>t)的多态性，扩展了现有技术检测这两个基因多态性的范围，使得检测巯嘌呤药物代谢能力更加全面准确，且灵敏度高，可以检测浓度低至1ng/μl的核酸样品，使用本发明的组合物中，能够同时适用全血样本和口腔拭子样本。

29、二、本发明基于荧光探针法设计了引物和探针，采用了4种不同的探针，实现一管试剂同时检测两个snp位点，整个4个snp使用两管试剂就能够实现检测，使得整个过程的操作都极其简单，结果读取过程通过扩增曲线和ct值即可以判定。

30、三、本发明的组合物检测准确度高，每一种探针采用不一样的荧光报告基团，避免了背景信号之间的互相干扰叠加；而现有技术如熔解曲线法，多条探针仅采用一种荧光报告基团，使得背景信号之间的互相干扰叠加增加了背景值使得结果的准确性降低，而使用本发明的组合物克服了这一缺点，使用本发明组合物的检测结果与二代测序结果一致，表明本发明组合物具有很高的准确性。上述概述仅仅是为了说明书的目的，并不意图以任何方式进行限制。