小麦抗白粉病基因PmYF267的KASP分子标记、检测方法及应用与流程

本发明属于小麦分子生物技术及育种应用领域，具体涉及一种用于检测小麦抗白粉病基因pmyf267的kasp分子标记、检测方法及应用。本发明可为小麦抗白粉病育种提供新的基因资源；与pmyf267紧密连锁的kasp分子标记可用于抗白粉病基因的分子标记辅助选择育种。

背景技术：

1、小麦是我国三大粮食作物之一，小麦优质绿色高产对保障国家粮食安全和农业可持续发展具有重大现实和战略意义。小麦白粉病是由禾本科布氏白粉菌小麦专化型(blumeria graminis f.sp.tritici,bgt)引起的一种真菌性病害，会导致小麦叶片枯萎、容易倒伏、籽粒灌浆不足和品质劣化，已成为我国小麦生产的主要病害。随着高氮、密植等栽培模式的变化以及高温、多雨的气候变化，小麦白粉病危害程度加剧。实践证明，选育和利用抗病品种是防治小麦白粉病的经济有效途径。

2、挖掘和鉴定抗病基因是培育抗白粉病品种的关键。尽管已报道的小麦抗白粉病基因位点有很多，但可实际用于抗病育种的抗源却很少。一方面是由于很多抗病基因源于小麦近缘物种，抗病基因导入小麦背景的同时会携带一些外源冗余基因，往往会对小麦农艺和品质性状带来不利影响。另一方面，大多数抗病基因都是病原菌生理小种专化抗性，长期大面积利用单一抗源会加速病原菌优势小种的变异，导致抗病基因抗性丧失。在我国，pm2、pm4、pm8等基因在各大麦区均有不同程度的抗性丧失，特别是pm8抗性丧失导致小麦白粉病又一轮爆发。在长江中下游麦区以及西南麦区，利用pm21培育的抗病品种激增，存在过度利用的风险。因此，不断挖掘新的抗病基因并解析其作用机制，对于合理利用抗源和拓宽小麦遗传基础都具有重要意义。

3、得益于麦类作物基因组学的快速发展，普通小麦、乌拉尔图小麦、节节麦、野生二粒小麦、硬粒小麦等麦类作物基因组测序工作相继完成，同时也促进了小麦snp(singlenucleotide polymorphism)芯片高通量测序技术的发展，极大推进了小麦功能基因的挖掘工作。丰富的snp位点信息，大大推动了dna变异检测及分子标记开发的效率，尤其是以snp为基础的第三代kasp(kompetitive allele specific pcr，kasp)分子标记。kasp技术是基于pcr过程中引物末端碱基特异性匹配来实现snp/indel(insertion-deletion)分型的方法，能够精确地进行双等位基因分型，可避免传统分子标记繁琐的筛选过程，具有高效率、高通量等优势，为基因挖掘、克隆及分子标记辅助育种提供了极大便利。

4、‘扬yf267’是江苏里下河地区农业科学研究所选育的优质高产多抗小麦新品系，其全生育期对当地的混合白粉菌株表现免疫。高感白粉病的‘扬09dpbz-2’也是由江苏里下河地区农业科学研究所选育的优质强筋小麦品系。利用扬09dpbz-2和扬yf267配制杂交组合，构建了大规模遗传分离群体。通过极端抗、感混池外显子捕获测序分析，在7a染色体上检测到1个主效抗白粉病基因，定名为“pmyf267”，该位点来源于抗白粉病亲本扬yf267。因此，开发pmyf267的紧密连锁标记，对提高该基因在小麦白粉病抗性育种中的选择效率具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种来自普通小麦品系‘扬yf267’的抗白粉病基因pmyf267，该基因可为小麦抗白粉病育种提供新的基因资源。

2、本发明的另一个目的在于提供与pmyf267紧密连锁的kasp分子标记。

3、本发明的第三个的在于提供上述小麦抗白粉病基因pmyf267紧密连锁的kasp分子标记的应用。

4、本发明的目的采用如下技术方案实现：

5、小麦抗白粉病基因pmyf267来自抗白粉病普通小麦品系‘扬yf267’，该基因定位于小麦7a染色体长臂，在中国春参考基因组v2.0版本的物理位置为685–697mb，该定位区间是一个染色体重组抑制区域。pmyf267对小麦白粉病的抗性表现为全生育期免疫。本发明提供了上述小麦抗白粉病基因pmyf267在小麦抗白粉病育种中的应用。

6、本发明提供了与小麦抗白粉病基因pmyf267紧密连锁的分子标记，该分子标记为7ak-685和7ak-697，上述两个分子标记与小麦抗白粉病基因pmyf267共定位于小麦7a染色体长臂上，并与pmyf267共分离。

7、本发明提供的与小麦抗白粉病基因pmyf267紧密连锁的分子标记7aid-667的多态性为c/t，7ak-697的多态性为g/a。

8、本发明提供的与小麦抗白粉病基因pmyf267紧密连锁的分子标记7ak-685由核苷酸序列如seq id no.1～3所示的3条引物pcr扩增获得。上述3条引物包括2条上游引物和1条通用下游引物，所述2条上游引物5’端分别修饰不同的荧光基团；3条引物的核苷酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示(下划线部分为荧光基团的序列)：

9、seq id no.1：gaaggtgaccaagttcatgctgcttgtctgcatctctcgatt

10、seq id no.2：gaaggtcggagtcaacggattgcttgtctgcatctctcgatc

11、seq id no.3：ctttggggcgcgtgcaat

12、本发明提供了与小麦抗白粉病基因pmyf267紧密连锁的kasp分子标记7ak-697由核苷酸序列如seq id no.3～5所示的3条引物pcr扩增获得。上述3条引物包括2条上游引物和1条通用下游引物，所述2条上游引物5’端分别修饰不同的荧光基团；3条引物的核苷酸序列分别如seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6所示(下划线部分为荧光基团的序列)：

13、seq id no.4：gaaggtgaccaagttcatgcttctcagaattttggccatctcag

14、seq id no.5：gaaggtcggagtcaacggatttctcagaattttggccatctcaa

15、seq id no.6：gcttgaccatgcgtgtttga

16、本发明提供的用于检测小麦抗白粉病基因pmyf267紧密连锁的kasp分子标记7ak-685的特异性引物组合，含有核苷酸序列如seq id no.1～3所示的引物。

17、本发明提供的用于检测小麦抗白粉病基因pmyf267紧密连锁的分子标记7ak-697的特异性引物组合，含有核苷酸序列如seq id no.4～6所示的引物。

18、上述的kasp分子标记，或上述的特异性引物组合在(1)～(3)中至少一种的应用：

19、(1)检测、定位和克隆小麦抗白粉病基因pmyf267；

20、(2)用于小麦抗白粉病基因pmyf267的分子标记辅助选择育种；

21、(3)鉴定或选育抗白粉病小麦品种。

22、一种检测小麦抗白粉病基因pmyf267的方法，采用上述的分子标记，或上述的特异性引物组合对待测小麦样品进行基因型判定：

23、①kasp分子标记7ak-685等位型为cc则为携带纯合pmyf267的抗病基因型，若等位型为c/t则为携带杂合pmyf267的抗病基因型，若等位型为tt则为不携带pmyf267的感病基因型。

24、②kasp分子标记7ak-697等位型为aa则为携带纯合pmyf267的抗病基因型，若等位型为a/g则为携带杂合pmyf267的抗病基因型，若等位型为gg则为不携带pmyf267的感病基因型。

25、上述的检测小麦抗白粉病基因pmyf267的方法具体包括以下步骤：

26、(1)提取待测小麦叶片的基因组dna作为模板；

27、(2)利用所述kasp分子标记7ak-685和7ak-697的特异性引物组合分别对待测样品的基因组dna进行pcr扩增，获得扩增产物；

28、(3)将扩增产物离心，观察pcr反应板底部，确保没有气泡；

29、(4)利用荧光定量pcr仪(abi vii)扫描pcr扩增产物基因型，35℃读取荧光信号，

30、(5)利用taqmangenotyper v1.3.1对扫描结果进行数据基因型分析；

31、(6)按照多态性位点基因分型对待测小麦样品进行基因型判定。

32、上述的步骤(2)中，所述的扩增反应体系：10-20ng/μl dna1.0μl、higeno 2×probe mix 5μl、引物混合液0.112μl、ddh2o 3.89μl，总体系为10μl。

33、所述的特异性引物组合配制成引物混合液的方法，将引物浓度均为100μm的上游引物1、上游引物2、下游引物与ddh2o按照体积比12:12:30:46混匀后得到引物混合液。

34、所述pcr扩增的程序为：95℃预变性15min；95℃变性20s、65℃梯度退火并延伸60s，共10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低1℃；95℃变性20s、57℃退火并延伸60s，共33个循环。

35、一种鉴定或选育抗白粉病小麦品种的方法，其特征在于，采用上述的分子标记，或上述的特异性引物组合对待测小麦样品进行基因型判定，选择携带基因pmyf267的抗病小麦品种：

36、①kasp分子标记7ak-685等位型为cc则为携带纯合pmyf267的抗病基因型，若等位型为c/t则为携带杂合pmyf267的抗病基因型，若等位型为tt则为不携带pmyf267的感病基因型。

37、②kasp分子标记7ak-697等位型为aa则为携带纯合pmyf267的抗病基因型，若等位型为a/g则为携带杂合pmyf267的抗病基因型，若等位型为gg则为不携带pmyf267的感病基因型。

38、本发明的有益效果：

39、(1)白粉病抗性好：本发明首次公开了来自普通小麦新品系‘扬yf267’的抗白粉病基因pmyf267，位于小麦7a染色体长臂上。pmyf267对小麦白粉病表现为全生育期免疫。该基因在小麦抗白粉病育种中具有较高的利用价值。

40、(2)精确度高：本发明公开了与小麦抗白粉病基因连锁的分子标记7aid-667和7ak-697，上述两个分子标记是抗病基因pmyf267的侧翼标记，紧密连锁。在育种过程中，利用上述标记的特异性引物组合进行pcr扩增，分子标记辅助选择抗白粉病基因pmyf267的准确性高。

41、(3)检测通量高：本发明公开的连锁分子标记为kasp标记，可以摆脱凝胶电泳的限制，检测通量高。在分子标记辅助育种中，可快速筛选出抗病单株，提高育种工作效率。

42、(4)共显性标记：本发明公开的连锁分子标记为共显性标记，可以区分纯合抗病和杂合抗病位点，分辨率高，在小麦抗白粉病基因pmyf267的精细定位、图位克隆和分子标记辅助育种方面的精度更高。