一种位于21号染色体上的肿瘤标记物及其应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其涉及一种位于21号染色体上的肿瘤标记物及其应用。

背景技术：

1、肿瘤的发生发展是一个复杂、多层面、多因素的动态过程，包含了外界环境、遗传学变异以及表观遗传学改变等多种因素的相互作用。外界环境因素包括物理、化学、生物等致癌因素以及不健康的生活习惯等；遗传学变异包括基因突变、拷贝数变化、染色体错位等；表观遗传学改变主要包括dna甲基化、组蛋白修饰、非编码rna等变化因素。在肿瘤的发生发展过程中，上述因素相辅相成，共同作用，导致一系列抑癌基因的失活以及原癌基因的激活，进而导致肿瘤。及时得发现并诊断在肿瘤治疗中具有重要意义。

2、随着人们对肿瘤认识的加深以及科学技术的进步，许多新型的肿瘤标记物被发现并用于临床诊断。1980年之前，肿瘤标记物主要是一些激素、酶类、蛋白质等细胞分泌物，例如癌胚抗原(cea)、甲胎抗原(afp)等可以作为胃癌和肝癌等多种肿瘤的标记物。目前这一类肿瘤标记物虽然临床仍在用，但其敏感性与准确性已难以满足现在的临床需求。现在基于突变的标记物也越来越多，如肿瘤抑制因子p53的突变、brca基因突变、结直肠癌中的微卫星不稳定等，然而这类标记物在早期肿瘤的发现和诊断中效果不太理想。利用基于dna甲基化的标记物可以在肿瘤发展的早期就可以将其诊断出来。

3、表观遗传学(epigenomics)是研究基因在不发生dna序列改变的情况下，基因功能的可遗传的变化，并最终导致表型变化的一门学科。表观遗传学主要包括dna甲基化(dnamethylation)、组蛋白修饰(histone modification)、microrna水平变化等生化过程。dna甲基化是研究较为深入的表观遗传学机制，在包括诊断和治疗在内的肿瘤临床实践中有着应用前景。dna甲基化是指生物体内在dna甲基转移酶(dnamethyltransferase，dmt)的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(sam)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。在哺乳动物中dna甲基化主要发生在5’-cpg-3’的c上，生成5-甲基胞嘧啶(5mc)。

4、在正常细胞中，一些cpg处于高度甲基化/转录沉默的状态，而在肿瘤细胞中这些cpg发生了广泛的去甲基化，导致重复序列的转录、转座子的活化，使得基因组高度不稳定和原癌基因转录增强。此外，一些原本在正常细胞中处于低甲基化状态的cpg岛在肿瘤细胞中会发生高甲基化，从而导致基因的转录失活，受影响的基因包括dna修复基因、细胞周期控制基因和抗凋亡基因等。基因组dna经亚硫酸氢盐处理后，通过pcr或测序等方式可以有效地确定特定位点的甲基化状态。利用上述技术，这些异常的dna甲基化状态，可以在肿瘤发生的早期就被检测到。

5、人类基因组全序列尽管已经被人们所掌握，但是基因组序列纷繁复杂，哪些基因或哪些区段与疾病密切相关，仍然不是很清楚。此外，由于肿瘤本身的复杂性，使得寻找到既敏感又特异的肿瘤标记物变得更加困难。在本发明中，发明人通过利用大量数据并结合更优化的方法，寻找出更精准的肿瘤标记物，为肿瘤的诊断提供更多的途径。

技术实现思路

1、本发明克服现有技术的缺陷，提供了一类dna表观修饰相关的肿瘤标记物，标记物在肿瘤患者中表现出显著性的高甲基化状态。

2、本发明的第一个方面，提供了一种肿瘤标记物，所述肿瘤标记物位于人类基因组1号染色体、2号染色体、3号染色体、5号染色体、7号染色体、8号染色体、10号染色体、11号染色体和21号染色体上，且包括一个或多个可发生甲基化修饰的cpg位点。

3、优选的，所述肿瘤标记物位于21号染色体上，所述肿瘤标记物包括位于人类基因组hg19上(坐标从0开始)chr21:38378275-38378539区域。

4、优选的，所述chr21:38378275-38378539区域选自以下组中的至少一种：a)seq idno.1所示的碱基序列；b)seq id no.1所示的碱基序列的互补序列；c)与seq id no.1至少70％同源性的核苷酸序列或其核苷酸序列的互补序列。

5、优选的，所述肿瘤标记物包括作为乳腺癌、宫颈癌、食管癌、头颈部癌、肺癌和胰腺癌中的一种或几种的标记物。

6、优选的，所述肿瘤标记物还包括作为膀胱癌、胆管癌、结肠癌、胶质母细胞瘤、肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌、肝癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌中的一种或几种的标记物。

7、优选的，所述甲基化修饰包括5-醛甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-甲基化修饰或5-羧甲基化修饰。

8、优选的，所述肿瘤标记物还包括位于人类基因组hg19上(坐标从0开始)chr2:105459135-105459190、chr10:124902392-124902455、chr3:157812331-157812498、chr8:97170353-97170404、chr5:134880362-134880455、chr10:94835119-94835252、chr11:31826557-31826963、chr3:147114032-147114108、chr10:50819227-50819589、chr2:66809255-66809281、chr7:97361393-97361461、chr8:70984200-70984294、chr1:6515341-6515409区域的一种或多种。

9、优选的，上述区域均各自选自以下组中的至少一种：a)表1中所示的碱基序列；b)所示的碱基序列的互补序列；c)与所示的碱基序列至少70％同源性的核苷酸序列或其核苷酸序列的互补序列。

10、上述各区域的靶序列及其反向互补序列如下表1所示。其中，加粗倾斜字体表示cpg位点，着重号下边的数字表示该检测位点的编号。

11、表1

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15、本发明的第二个方面，提供了本发明所述的肿瘤标记物的应用，所述应用选自以下应用中的一种：所述肿瘤标记物在制备肿瘤的筛选试剂、预后试剂、检测试剂或诊断试剂中的应用；所述肿瘤标记物在作为肿瘤的药物靶点中的应用；所述肿瘤标记物在制备抑制肿瘤增生的药物中应用；检测所述肿瘤标记物cpg位点甲基化水平的试剂在制备检测肿瘤的试剂中的应用。其中，所述cpg位点如上表1所示。

16、优选的，所述肿瘤包括：膀胱癌、宫颈癌、胆管癌、结肠癌、食道癌(食管癌)、胶质母细胞瘤、头颈部癌、肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌、肝癌、肺癌(肺腺癌)、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌；进一步优选的，所述肿瘤包括：乳腺癌、宫颈癌、食管癌、头颈部癌、肺癌、胰腺癌。具体地，例如seq id no.1或其反义互补序列可作为标记物的肿瘤包括：可作为标记物的肿瘤包括：膀胱癌、宫颈癌、胆管癌、结肠癌、食道癌、胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌、肝癌、肺腺癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌(进一步优选的：膀胱癌、宫颈癌、胆管癌、结肠癌、食道癌、胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌、肝癌、肺腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌)。

17、优选的，在上述应用中，所述检测试剂为肿瘤标记物检测试剂盒，其包括特异性检测所述肿瘤标记物的引物或探针；和/或，所述抑制肿瘤增生的药物为所述肿瘤标记物的抑制剂。进一步优选的，所述引物或探针为特异性检测所述肿瘤标记物cpg位点甲基化的引物或探针；所述抑制剂为甲基化抑制剂。

18、本发明的第三个方面，提供了一种抑制肿瘤增生的药物，所述药物包含本发明所述的肿瘤标记物的抑制剂。优选的，所述抑制剂为甲基化抑制剂；进一步优选的，所述抑制剂为抑制上表1中的一种或多种cpg位点甲基化的抑制剂。上述药物还可包括药学上可接受的载体。

19、本发明的第四个方面，提供了一种肿瘤标记物的检测方法，包括以下步骤：s1、获取待检测组织样本；s2、抽提待检测组织样本dna，获取样本的甲基化值；s3、计算出在所述肿瘤标记物序列区域内的每个cpg位点的甲基化情况或整个区域的平均甲基化情况。

20、优选的，步骤s2中获取样本的甲基化值的方法包括测序、探针、抗体、质谱等。

21、本发明的第五个方面，提供了一种肿瘤标记物检测试剂盒，包括特异性检测本发明所述的肿瘤标记物的引物或探针。优选的，所述特异性检测肿瘤标记物包括特异性检测所述肿瘤标记物的cpg位点的甲基化；其中，所述肿瘤标记物的cpg位点的甲基化为5-甲基化，包括5-醛甲基化、5-羟甲基化或5-羧甲基化。

22、本发明相对于现有技术具有如下优点：本发明提供了一类dna表观修饰相关的肿瘤标记物，所述标记物在肿瘤患者中表现出显著性的高甲基化状态。所述肿瘤标记物可用于肿瘤的临床辅助的筛查、诊断以及预后等，或可用于设计诊断试剂及试剂盒等等。