本发明属于生物医用材料的,具体涉及一种光固化的透明质酸基复合水凝胶及其制备与应用。
背景技术:
1、关节软骨是无血管、无淋巴的结缔组织,由软骨细胞、细胞外基质及大量的水组成,自修复能力很弱。因此软骨损伤修复一直是再生医学领域的难题。软骨组织工程是将支架材料与细胞、生长因子相结合的一种方法,被认为是软骨组织修复最有前景的研究方向。目前软骨组织工程已应用到临床,即自体软骨细胞移植术(aci),但其存在着软骨细胞增殖过程中功能丢失、再生软骨纤维化和手术失败率高等问题,限制了其在临床上的广泛应用。
2、水凝胶是通过物理或化学交联形成的富含水的三维网络,具有与细胞外基质高度相似的结构和性质,因而在生物医学领域得到了广泛研究应用。水凝胶对软骨细胞进行三维包载有利于营养物质和代谢废物的交换运输,提供增殖生长的空间,可为软骨细胞提供适宜的生长微环境。与细胞直接接触的生物材料的力学性能会通过机械应力转导影响细胞行为,研究表明类细胞外基质的应力松弛环境更有利于细胞的黏附、迁移和增殖。
3、透明质酸是软骨细胞外基质中的重要组分,其能与细胞表面的cd44受体结合对细胞行为造成影响。透明质酸会刺激软骨细胞的代谢活动,能显著促进聚集蛋白聚糖、ii型胶原蛋白的分泌。软骨细胞能利用半乳糖为原料合成糖胺聚糖,半乳糖可促进软骨细胞分泌基质,半乳糖聚合物较半乳糖分子而言在水凝胶中的存留时间更长,能够为负载于凝胶中的软骨细胞提供基质分泌所需营养物质。
4、本发明制备的水凝胶以透明质酸为主体材料,通过接枝的苯硼酸官能团与半乳糖聚合物间形成动态苯硼酸酯键,既为软骨细胞制造了应力松弛微环境,还大量提供了其分泌基质所需的营养物质。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足,提供了一种用于软骨组织工程的光固化的透明质酸基复合水凝胶及其制备方法。本发明利用光引发自由基聚合以及苯硼酸基团和1,2-或1,3-二醇间形成苯硼酸酯键,得到了具有良好生物相容性和应力松弛特性的水凝胶,可以包裹细胞原位注射光固化成胶,成胶过程温和快速,在软骨组织工程领域具有广泛的应用前景。本发明的复合水凝胶用于软骨组织工程。
2、为了实现以上目的,本发明所提供的技术方案为:
3、一种光固化的透明质酸基复合水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
4、在缓冲溶液中,将改性透明质酸和半乳糖聚合物以及光引发剂混合,光固化,获得透明质酸基复合水凝胶。
5、所述改性透明质酸的结构式为式i:
6、
7、其中n>0且n为整数。
8、所述半乳糖聚合物的结构式为式ii:
9、
10、其中n为25~100的整数。
11、所述改性透明质酸在缓冲溶液中的质量浓度为1~10%,半乳糖聚合物在缓冲溶液中的质量浓度为0.1~5%。
12、所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液。
13、所述光引发剂为光引发剂i2959、光引发剂lap、光引发剂va-086中一种以上。
14、所述光引发剂在缓冲溶液中的质量浓度为0.1~0.5%。缓冲溶液的密度按照1g/ml计算。
15、所述光固化为紫外光固化,光照的时间为1~5min。
16、所述改性透明质酸的制备,包括以下步骤:
17、1)在吗啉乙磺酸缓冲液中,采用活化剂将透明质酸进行活化;然后加入3-氨基苯硼酸一水合物,反应,透析冻干,得到苯硼酸改性透明质酸;
18、2)在水中,将高碘酸钠与苯硼酸改性透明质酸进行反应,透析冻干,得到氧化的苯硼酸改性透明质酸;
19、3)低温下,将甲基丙烯酸酐与氧化的苯硼酸改性透明质酸的水溶液混合,将ph值调节至碱性后反应,离心取上清液透析冻干,获得氧化的苯硼酸和双键改性透明质酸。
20、步骤1)中,所述透明质酸和3-氨基苯硼酸一水合物的质量比为5∶1~10∶1。
21、步骤1)中,所述活化剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐或edc/nhs体系。
22、步骤1)中,所述反应的时间为12~36h。所述反应为避光室温反应。
23、步骤1)中,所述透析是指使用截留分子量为8000~14000的透析袋进行透析,透析时间为3~5天。
24、步骤2)中,所述苯硼酸改性透明质酸和高碘酸钠的质量比为1∶1~5∶1。
25、步骤2)中,所述反应的时间为0.5~6h。
26、步骤2)中,所述透析是指使用截留分子量为8000~14000的透析袋进行透析,透析时间为3~5天。
27、步骤3)中,所述低温的温度为1~4℃,所述ph值为8~10,所述反应的时间为12~24h。
28、步骤3)中,所述氧化的苯硼酸改性透明质酸和甲基丙烯酸酐的质量比为1∶2~1∶7。
29、所述甲基丙烯酸酐采用滴加的方式加入。
30、所述ph值调节至碱性中调节是指采用碱进行调节,如:naoh。
31、步骤3)中,所述透析是指使用截留分子量为8000~14000的透析袋进行透析,透析时间为3~5天。
32、所述的半乳糖聚合物的制备,包括以下步骤:
33、s1)将6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖与引发剂和链转移剂溶于有机溶剂中,进行聚合反应;猝灭反应,后续处理,得到聚(6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖);
34、s2)将步骤s1)得到的聚(6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖)用三氟乙酸溶液脱去吡喃糖环上的羟基保护基团异亚丙基,经透析冻干得到聚(6-o-甲基丙烯酰基-d-半乳糖)。
35、步骤s1)中,所述引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯、过氧化二苯甲酰中一种以上。
36、步骤s1)中,所述链转移剂为4-氰基-4(苯基硫代甲酰硫基)戊酸。
37、步骤s1)中,所述有机溶剂为1,4-二氧六环、四氢呋喃、n,n二甲基甲酰胺中一种以上。
38、步骤s1)中,所述6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖与链转移剂的摩尔比为50∶1~120∶1,所述引发剂与链转移剂的摩尔比为1∶4~1∶6。
39、步骤s1)中,所述聚合反应的条件为无氧环境下65~80℃下反应12~48h。
40、步骤s1)中,所述猝灭反应是指进行低温猝灭,所述低温是指-20℃~-80℃。
41、步骤s1)中,所述后续处理为用甲醇醇沉后真空干燥。
42、步骤s2)中,所述三氟乙酸溶液中三氟乙酸与水的体积比为5∶1~3∶1。
43、步骤s2)中,所述透析是指使用截留分子量为3000的透析袋进行透析,透析时间为3~5天。
44、所述光固化的透明质酸基复合水凝胶通过上述制备方法得到。
45、所述光固化的透明质酸基复合水凝胶在组织工程领域中的应用,特别是软骨组织工程领域,用作软骨细胞三维培养和/或软骨修复。
46、所述光固化的透明质酸基复合水凝胶用于软骨细胞三维培养,包括以下步骤:
47、(1)将软骨细胞与水凝胶预聚液混合,得到复合物;复合物中细胞密度为1×105~1×107个/ml预聚液;所述水凝胶预聚液为前面所述透明质酸基复合水凝胶光固化前的混合液;
48、(2)将复合物注入细胞培养装置中,在365nm紫外光下照射1~3min,实现对软骨细胞的三维包封。
49、本发明的水凝胶用于软骨组织工程领域,包括软骨细胞三维培养及病损软骨修复等。本发明通过光引发自由基聚合的方式制备同时含有静态共价交联和苯硼酸酯动态交联的水凝胶,反应条件温和,制得的水凝胶具有良好的生物相容性和应力松弛特性,同时多种成分构成的复合水凝胶的微环境有利于软骨细胞形态和功能维持。
50、本发明与现有技术相比,具有以下优点和有益效果:
51、(1)本发明所用原料透明质酸为天然提取物,来源广泛,是软骨细胞外基质的重要组分,能为软骨细胞提供更相似的生长微环境。
52、(2)本发明的水凝胶制备过程简单容易操作,制备条件温和,有利于软骨细胞的三维包封。
53、(3)本发明制备的水凝胶具有应力松弛特性,更有利于软骨细胞的生长、增殖及特征基质分泌。
54、(4)本发明中的半乳糖聚合物可用于软骨细胞的营养物。