新化合物的制作方法

本发明涉及4-(1-羟基-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)苄脒衍生物及其在治疗由异常高水平的蛋白酶活性(特别是丝氨酸蛋白酶，诸如激肽释放酶)引起的皮肤疾病和病症中的用途(例如netherton综合征、酒渣鼻、特应性皮炎、银屑病和瘙痒)。此外，本发明涉及含有衍生物的组合物及其制备方法。

背景技术：

1、netherton综合征是一种以异常脱皮和慢性皮肤炎症为特征的遗传性皮肤病。皮肤屏障功能的丧失导致严重的脱水和对感染的高度敏感性。存在高的出生后死亡率，而且生命早期通常无法茁壮成长。患者患有持续性瘙痒(发痒)。红皮病很常见并且鱼鳞病经常发展。所有患者变得特应性，既表现为皮肤过敏又表现为食物过敏。

2、netherton综合征由spink-5基因的突变引起，并以常染色体隐性方式遗传。已知存在超过40种突变，但所有突变都会导致皮肤中基因产物(淋巴上皮kazal型相关抑制剂(lekti))的表达部分或完全丧失(chavanas et al,nature genetics(2000),25(2),141-2)。

3、lekti是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，其与丝氨酸蛋白酶(例如激肽释放酶5、7和14(klk-5、-7和-14))一起在表皮的最分化层中表达。在正常情况下，lekti以表皮中的较低水平抑制蛋白酶活性，但是该抑制在更加酸性的角质层外层中丧失，从而裂解角质体并丧失最外层(脱皮)。lekti的缺乏增加了角质层中的蛋白酶活性，这导致桥粒蛋白的不适当裂解和整个外皮肤层的丧失。

4、表皮内的异常蛋白酶活性还激活par-2并引发以th-2型细胞因子(如tslp)增加为特征的炎症反应。这导致观察到红皮病和该疾病特征性的深层瘙痒。在生命早期，免疫系统就倾向于th2响应，这也解释了这些患者中特应性的高患病率。

5、皮肤外层中klk-5活性的抑制将抵消lekti的部分或完全缺失，这引发netherton综合征。这将通过减少异常脱皮来恢复皮肤屏障功能，并通过阻止par-2受体的活化来减少红皮病和瘙痒，从而减少随后的炎症驱动力。

6、酒渣鼻是估计影响30岁以上美国人口的3％的炎症性皮肤病，其特征是红斑、丘疹和毛细血管扩张。酒渣鼻中已报道皮肤中蛋白酶活性增加(yamasaki k,et al.nat.med.(2007)13:975–80)。大量工作证实酒渣鼻中klk-5表达增加的病理生理作用(two a,etal.,j clin aesthet dermatol(2014)7(1):20-25)。此外，已经表明用于治疗酒渣鼻的活性成分(如壬二酸)具有抑制klk-5的治疗作用(coda a.et al.,j am acad dermatol(2013)69(4):570-577)。这些数据表明激肽释放酶蛋白酶途径的抑制剂，尤其是klk-5抑制剂在治疗酒渣鼻中的有用性。

7、特应性皮炎(ad)是特征在于湿疹、瘙痒和皮肤对环境因素的过度活跃的慢性炎症性皮肤病。ad中临床未受影响的皮肤表现出皮肤屏障功能受损，有利于微生物和过敏原渗透。ad最通常从5岁之前的儿童期开始，并且约25％的儿童在成年后仍继续患有这种病症。spink-5中的多态性已经与特应性皮炎相关(walley et al,nature genetics 29(2001))，因此抑制klk途径可能在治疗ad中有效。

8、银屑病是特征在于角质形成细胞增殖和分化紊乱的慢性炎症性皮肤病，其导致覆盖有银色的鳞片的发红、干裂、硬皮状皮肤斑块，可能会疼痛或发痒。斑块的程度可随严重性从小和局部到完全机体覆盖。在银屑病病灶中，t细胞和树突状细胞活性导致异常的蛋白酶活性(komatsu,n.et al,british journal of dermatology(2007)156(5):875-883)，因此抑制klk途径可能在治疗银屑病中有效。

9、考虑到丝氨酸蛋白酶(如klk-5)在裂解桥粒蛋白中的作用，期望制备抑制klk-5活性的化合物，该化合物可用于治疗由klk-5途径介导的疾病和综合征。

10、发明概述

11、根据第一方面，本发明提供式(i)化合物或其药学上可接受的盐，

12、

13、其中r1、r2和r3于本文中限定。

14、本发明的其他方面包括：

15、i)使用式(i)化合物或其药学上可接受的盐治疗由klk-5途径介导的疾病和病症的方法；示例性疾病和病症包括但不限于netherton综合征、酒渣鼻、特应性皮炎、银屑病和瘙痒。

16、ii)药物组合物，其包含a)式(i)化合物或其药学上可接受的盐和b)药学上可接受的载体或赋形剂；和

17、iii)式(i)化合物或其药学上可接受的盐用于治疗由klk-5途径介导的疾病和病症的用途。

18、发明详述

19、根据第一方面，本发明提供式(i)化合物或其药学上可接受的盐，

20、

21、其中r1是h，r2是cf3，并且r3是3-吡啶基甲氧基、3-氯苄氧基或h；

22、r1是cl，r2是f，并且r3是3-吡啶基甲氧基；或

23、r1是h，r2是h，并且r3是3-吡啶基甲氧基。

24、在一个实施方案中，式(i)化合物选自下组：

25、4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄脒(化合物1)；

26、2-((3-氯苄基)氧基)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)苄脒(化合物5)；

27、4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)苄脒(化合物6)；

28、4-(6-氯-7-氟-1-羟基-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄脒(化合物7)；和

29、4-(1-羟基-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄脒(化合物8)；

30、或其药学上可接受的盐。

31、在一个实施方案中，式(i)化合物是4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄脒

32、

33、或其药学上可接受的盐。

34、在一个实施方案中，式(i)化合物是2-((3-氯苄基)氧基)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)苄脒

35、

36、或其药学上可接受的盐。

37、在一个实施方案中，式(i)化合物是4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)苄脒

38、

39、或其药学上可接受的盐。

40、在一个实施方案中，式(i)化合物是4-(6-氯-7-氟-1-羟基-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄脒

41、

42、或其药学上可接受的盐。

43、在一个实施方案中，式(i)化合物是4-(1-羟基-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄脒

44、

45、或其药学上可接受的盐。

46、如第一方面所定义的式(i)化合物包含碱性中心并且可以与无机酸(如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸和磷酸)，与羧酸或与有机磺酸形成无毒的酸加成盐。实例包括4-乙酰氨基苯甲酸盐、乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐(苯磺酸盐)、苯甲酸盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、丁酸盐、依地酸钙、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐(樟脑磺酸盐)、癸酸盐(癸酸盐)、己酸盐(己酸盐)、辛酸盐(辛酸盐)、肉桂酸盐、柠檬酸盐、环磺酸盐、二葡萄糖酸盐、2,5-二羟基苯甲酸盐、二琥珀酸盐、十二烷基硫酸盐(丙酸酯十二烷基硫酸盐)、乙二胺四乙酸盐(乙二胺四乙酸盐)，丙酸酯十二烷基硫酸盐(月桂基硫酸盐)、1,2-乙烷基二磺酸盐(乙二磺酸盐)、乙烷磺酸盐(乙磺酸盐)、甲酸盐、富马酸盐、半乳糖酸盐(粘酸盐)、龙胆酸盐(2,5-二羟基苯甲酸盐)、葡庚糖酸盐(葡庚糖酸盐)、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、谷氨酸盐、戊二酸盐、甘油磷酸盐、乙醇酸盐、己基间苯二酸盐、马尿酸盐、海巴青霉素(n,n’-二(脱氢松香基)-乙二胺)、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、羟萘甲酸盐、异丁酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐(甲磺酸盐)、甲基硫酸盐、粘酸盐，萘-1,5-二磺酸盐(萘二磺酸盐)、萘-2-磺酸盐(萘磺酸盐)、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、对氨基苯磺酸盐、对氨基水杨酸盐、双羟萘酸盐(双羟萘酸盐)、泛酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯乙酸盐、苯乙基巴比土酸盐、磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、对甲苯磺酸盐(甲苯磺酸盐)、焦谷氨酸盐、丙酮酸盐、水杨酸盐、癸二酸盐、硬脂酸盐、次乙酸盐、琥珀酸盐、氨基磺酸盐、硫酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、氯茶碱(8-氯茶碱酸盐)，硫氰酸盐、三乙基碘(triethiodide)、十一酸盐、十一碳烯酸盐和戊酸盐。药学上可接受的盐尤其包括berge,j.pharm.sci.,1977,66,1-19中描述的那些或p h stahl and c g wermuth,editors,handbook of pharmaceutical salts；properties,selection and use,secondedition stahl/wermuth:wiley-vch/vhca,2011中列出的那些(参见http://www.wiley.com/wileycda/wileytitle/productcd-3906390519.html)。

47、可以在最终分离和纯化式(i)化合物期间原位制备盐。或者，可以通过本领域已知的方法制备盐，包括用无机或有机酸处理。将理解，如果式(i)化合物包含两个或更多个碱性部分，则盐形成的化学计量可包括1、2或更多个当量的酸。该盐将包含1、2或更多个酸抗衡离子，例如二盐酸盐。

48、式(i)化合物的药学上可接受的盐的化学计量和非化学计量形式包括在本发明的范围内，包括亚化学计量的盐，例如其中抗衡离子包含一个以上酸性质子的盐。

49、本领域技术人员将理解，可以在最终的脱保护阶段之前制备的在第一方面中定义的化合物的某些受保护的衍生物可能本身不具有药理活性，但在某些情况下可以口服或胃肠外施用，然后在体内代谢以形成第一方面定义的具有药理活性的化合物。因此，此类衍生物可被描述为“前药”。在第一方面中定义的化合物的所有受保护的衍生物和前药都包括在本发明的范围内。适用于本发明化合物的前药的实例描述于drugs of today,volume 19,number 9,1983,pp 499–538和topics in chemistry,chapter 31,pp 306–316 and in“design of prodrugs”by h.bundgaard,elsevier,1985,chapter 1(通过引用将所述文献的公开内容并入本文)。本领域技术人员将进一步理解，当在第一方面定义的化合物内存在这种官能团时，可以将本领域技术人员已知为“前部分”的某些部分，例如，如h.bundgaard在“design of prodrugs”所描述(通过引用将所述文献的公开内容并入本文)的，置于适当的官能团上。因此，在另一方面，本发明提供了在第一方面中定义的化合物的前药。

50、在第一方面中定义的化合物、其药学上可接受的盐或前药可以以溶剂化或水合形式存在。因此，在另一方面，本发明提供了在第一方面中定义的化合物或其药学上可接受的盐的溶剂化物或水合物。

51、在第一方面中定义的化合物、其药学上可接受的盐或溶剂化物或水合物可以以一种或多种多晶型形式存在。因此，在另一方面，本发明提供了在第一方面中定义的化合物或其药学上可接受的盐的多晶型物，或在第一方面中定义的化合物或其药学上可接受的盐的溶剂化物或水合物的多晶型物。

52、在下文中，第一方面定义的化合物、其盐和前药；任何盐或前药的任何溶剂化物或水合物；以及任何化合物、盐、溶剂化物或水合物的任何多晶型物都称为“本发明化合物”。术语“本发明化合物”还包括针对第一方面描述的所有实施方案。

53、本发明的化合物可以具有一个或多个手性中心，因此以多种立体异构形式存在。所有的立体异构体及其混合物都包括在本发明范围内。外消旋化合物可以使用制备型hplc或制备型sfc和具有手性固定相的柱分离，或者使用本领域技术人员已知的方法拆分以产生单个对映体。

54、此外，可拆分外消旋中间体化合物并用于制备本发明的手性化合物。此外，本发明的手性化合物可以通过手性合成来制备。

55、在一个实施方案中，式(i)化合物是(r)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄脒

56、

57、或其药学上可接受的盐。

58、在一个实施方案中，式(i)化合物是(s)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄脒

59、

60、或其药学上可接受的盐。

61、本发明的化合物可以一种或多种互变异构形式存在。所有互变异构体及其混合物均包括在本发明的范围内。例如，主张2-羟基喹啉基还将涵盖其互变异构形式，α-喹啉酮基。

62、本发明还包括本发明化合物的所有合适的同位素变体。本发明化合物的同位素变体定义为其中至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量不同于自然界通常发现的原子质量的原子取代的那些。可掺入本发明化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别如2h、3h、11c、13c、14c、15n、17o、18o、35s、18f和36cl。本发明的某些同位素变体，例如其中掺入了放射性同位素(如3h或14c)的那些，可用于药物和/或底物组织分布研究。由于其易于制备和可检测性，氚化(即3h)和碳-14(即14c)同位素是特别优选的。此外，用同位素如氘(即2h)取代可提供由于更高的代谢稳定性而产生的某些治疗优势，例如，增加的体内半衰期或降低的剂量要求，因此在一些情况下是优选的。本发明化合物的同位素变体通常可以使用合适试剂的适当的同位素变体通过常规方法(如通过说明性方法或通过在下文实验部分中描述的制备方法)来制备。

63、本发明化合物可以以多种方式制备。在以下反应方案中，除非另有说明，r1至r3如第一方面所定义。这些方法构成本发明的其他方面。

64、在整个说明书中，通式用罗马数字(i)、(ii)、(iii)、(iv)等表示。这些通式的子集定义为(ia)、(ib)、(ic)等…(iva)、(ivb)、(ivc)等。

65、通式(i)化合物可以根据反应方案1由式(ii)化合物制备。合适的反应条件包括在低温(例如-78℃)下用气态氯化氢处理式(ii)化合物，然后用甲醇氨处理。

66、方案1

67、

68、式(i)化合物的盐酸盐可通过用甲醇盐酸处理式(i)化合物来制备。

69、通式(ii)化合物可以根据反应方案2由式(iii)化合物制备。合适的反应条件包括在130℃下在1,4-二氧六环中混合式(iii)化合物与5,5,5',5'-四甲基-2,2-二(1,3,2-二氧硼杂)、乙酸钾和pdcl2(dppf)。

70、方案2

71、

72、通式(iii)化合物可以根据反应方案3由式(iv)化合物制备。合适的条件包括在乙醇中用硼氢化钠处理。

73、方案3

74、

75、式(iiia)化合物，即其中与羟基连接的碳原子为手性的通式(iii)化合物，可以根据方案4中所示的三步过程制备。用适当的不对称氢化剂处理得到对映体富集的醇(iiib)混合物。用手性酸(v)处理(iiib)得到酯(vi)的非对映异构体混合物，其可以通过色谱或结晶分离。脱酯反应显示出所需的手性醇(iiia)。

76、方案4

77、

78、式(iv)化合物可以通过多种方法制备。例如，可以根据反应方案5由式(vii)和(viii)的化合物制备式(iv)化合物。合适的反应条件包括在高温下加热干燥的1,4-二恶烷中(vii)、(viii)、呫吨、pd2(dba)3和碱(例如叔丁醇钠或碳酸铯)的溶液。

79、方案5

80、

81、或者，可以根据反应方案6由式(ix)和(x)的化合物制备式(iv)化合物。合适的条件包括在thf中用nahmds处理。

82、方案6

83、

84、式(xa)的化合物，即其中r3为3-氯苄氧基或3-吡啶基甲氧基的通式(x)化合物，可以根据反应方案7由式(xi)化合物制备。合适的条件包括在适当的溶剂(例如dmf)中在低温(例如0℃)下，(分别)用氢化钠处理3-氯苄醇或3-吡啶基甲醇，然后在适当的溶剂中滴加(xi)。

85、方案7

86、

87、化合物(xi)可以根据反应方案8由式(xii)化合物制备。合适的反应条件包括在升高的温度(例如120℃)下使(xii)、氰化锌、四甲基乙二胺、pd2(dba)3和呫吨反应。

88、方案8

89、

90、化合物(xii)可以根据反应方案9由化合物(xiii)制备。合适的反应条件包括在0℃下使(xiii)在合适的溶剂(例如thf)中与甲基氯化镁反应。

91、方案9

92、

93、化合物(xiii)可以根据反应方案10由化合物(xiv)制备。合适的反应条件包括使(xiv)与草酰氯/dmf反应形成相应的酰氯，然后与n,o-二甲基羟胺盐酸盐和三甲胺反应。

94、方案10

95、

96、化合物(xiv)是本领域已知的并且可商购。

97、或者，式(xa)化合物可以根据反应方案11由化合物(xv)制备。合适的条件包括在三苯基膦和(e)-双(2-甲氧基乙基)二氮杂1,2-二羧酸酯存在下使(xv)与3-氯苄醇或3-吡啶基甲醇反应，或通过烷基化条件，包括例如在碱(例如碳酸钾)存在下，使(xv)与3-氯苄基溴或3-吡啶基甲基溴反应。

98、方案11

99、

100、化合物(xv)可以根据反应方案12由化合物(xvi)制备。合适的反应条件包括在升高的温度(例如140℃)下在二甲基乙酰胺中用三水合亚铁氰化钾、碳酸钠和乙酸钯(ii)处理(xvi)。

101、方案12

102、

103、化合物(xvi)是本领域已知的并且可商购。

104、本发明化合物可用于治疗由klk-5途径介导的疾病或病症。

105、如本文所用，关于疾病或病症的“治疗”是指：(1)减轻疾病或病症或疾病或病症的一种或多种生物学表现，(2)干扰(a)导致或引起疾病或病症的生物级联中的一个或多个点，或(b)疾病或病症的一种或多种生物学表现，(3)减轻与疾病或病症相关的一种或多种症状或效应，(4)减慢疾病或病症或疾病或病症的一种或多种生物学表现的进展，和/或(5)降低疾病或病症的严重程度或疾病或病症的生物学表现的可能性。

106、在向患者施用之前，通常但并非必须通过适当的途径将本发明化合物配制成药物组合物。因此，在另一方面，本发明提供了包含本发明化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

107、如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”是指存在于药物组合物或剂型中除本发明的一种或多种化合物之外的任何药学上可接受的物质。典型地，该材料赋予药物组合物形式、一致性和性能。

108、本发明的药物组合物典型地包含一种本发明化合物。但是，在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含一种以上的本发明化合物。另外，本发明的药物组合物可以包含一种或多种另外的药学上活性的化合物。

109、可以以散装形式制备和包装本发明的此类药物组合物，其中可以分配安全有效量的本发明化合物，然后例如以粉末或糖浆给予患者。或者，可以将本发明的药物组合物制备和包装为剂型，其中每种物理上离散的剂型均包含安全有效量的本发明化合物。因此，另一方面，本发明提供了包含本发明药物组合物的剂型。每个离散剂型典型地包含0.1mg-3000mg的本发明化合物。

110、本发明的组合物将典型地被配制成适合通过所需施用途径向患者施用的剂型。例如，剂型包括适于以下施用途径的那些：(1)口服施用，例如片剂、胶囊、囊片、丸剂、锭剂、粉末、糖浆、酏剂、混悬液、溶液、乳剂、小药囊和扁囊；(2)肠胃外施用，例如无菌溶液、混悬液、植入物和用于重构的粉末；(3)透皮施用，例如透皮贴剂；(4)直肠和阴道施用，如栓剂、子宫托和泡沫；(5)吸入和鼻内，例如干粉、气雾剂、混悬液和溶液(喷雾剂和滴剂)；(6)局部施用，例如乳膏、软膏、洗剂、溶液、糊剂、喷雾剂、泡沫和凝胶；(7)口腔和舌下施用，例如锭剂、贴剂、喷雾剂、滴剂、口香糖和片剂。

111、合适的药学上可接受的赋形剂将根据所选的特定剂型而变化。此外，可以针对它们可以在组合物中起的特定功能来选择合适的药学上可接受的赋形剂。例如，可以针对它们具有促进产生均匀剂型的能力而选择某些药学上可接受的赋形剂。可以针对它们具有促进产生稳定剂型的能力而选择某些药学上可接受的赋形剂。可以针对它们一旦向患者施用，具有易于将本发明的一种或多种化合物从机体的一个器官或部分携带或运输到机体的另一器官或部分的能力而选择某些药学上可接受的赋形剂。可以针对它们具有增强患者依从性的能力而选择某些药学上可接受的赋形剂。可以针对它们具有以以合适的速率促进本发明化合物的释放以治疗病症的能力而选择某些药学上可接受的赋形剂。

112、合适的药学上可接受的赋形剂包括以下类型的赋形剂：稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、制粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、助溶剂、悬浮剂、乳化剂、甜味剂、调味剂、香味掩蔽剂、着色剂、抗结块剂、湿润剂、螯合剂、增塑剂、增粘剂、速率改性剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲剂。本领域技术人员将理解，取决于制剂中存在多少赋形剂和制剂中存在什么其他成分，某些药学上可接受的赋形剂可以起到一种以上的功能并且可以起到替代的功能。

113、技术人员具有本领域的知识和技能，以使他们能够确定合适量的合适的药学上可接受的赋形剂，以与本发明化合物一起使用。此外，技术人员可获得许多描述药学上可接受的赋形剂的资源，这些资源可用于选择合适的药学上可接受的赋形剂。实例包括remington's pharmaceutical sciences(mack publishing company)、the handbook ofpharmaceutical additives(gower publishing limited)和the handbook ofpharmaceutical excipients(the american pharmaceutical association and thepharmaceutical press)。可以使用本领域技术人员已知的技术和方法来制备本发明的药物组合物。remington's pharmaceutical sciences(mack publishing company)描述了本领域中常用的一些方法。

114、在一个实施方案中，剂型适合于局部施用，例如乳膏、软膏、洗剂、溶液、糊剂、喷雾剂、泡沫和凝胶。

115、适用于局部施用的制剂包括适于穿过皮肤渗透至炎症位点的液体或半液体制剂，例如适于施用于皮肤的擦剂、洗剂、乳膏、软膏和糊剂。

116、根据本发明的洗剂包括适用于皮肤的那些。用于皮肤的洗剂或擦剂可以包括用于加速干燥和冷却皮肤的试剂，如酒精或丙酮，和/或保湿剂，如甘油或油(例如蓖麻油或花生油)。

117、根据本发明的乳膏、软膏或糊剂是用于外部施用的活性成分的半固体制剂。它们可以通过在合适机械的帮助下，在水性或非水性流体中，将细分或粉末形式的活性成分单独或以溶液或悬浮液的形式与油脂性或非油脂性基质混合来制备。所述基质可包含烃，例如硬、软或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂；粘液；天然来源的油，例如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂或其衍生物或脂肪酸(如硬脂酸或油酸)与醇(如丙二醇)或大粒凝胶。制剂可以掺入任何合适的表面活性剂，例如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂，如脱水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物。也可以包括悬浮剂(如天然树胶、纤维素衍生物)或无机材料(如硅土二氧化硅)以及其他成分(如羊毛脂)。

118、对于局部施用，本发明化合物可以包含0.001重量％-10重量％w/w，例如1重量％-2重量％的制剂。然而，其可以包含多达10％w/w的制剂，但是优选地将包含小于5％w/w，更优选0.1％-3％w/w的制剂。

119、应当理解，本发明包括以下进一步的方面。上述疾病和病症在适当的情况下扩展到这些进一步的方面。另外，以上关于第一方面定义的实施方案扩展到这些进一步的方面。

120、i)本发明化合物在制备用于治疗由klk-5途径介导的疾病或病症的药物中的用途。在一个实施方案中，所述疾病或病症选自下组：netherton综合征、酒渣鼻、特应性皮炎、银屑病和瘙痒。

121、ii)在人中治疗由klk-5受体介导的疾病或病症的方法，其包括施用有效量的本发明化合物。在一个实施方案中，所述疾病或病症选自下组：netherton综合征、酒渣鼻、特应性皮炎、银屑病和瘙痒。

122、iii)药物组合物，其包含a)本发明化合物和b)一种或多种药学上可接受的赋形剂。

123、iv)药物组合物，其包含a)0.05-3000mg的本发明化合物和b)0.1-100g的一种或多种药学上可接受的赋形剂。

124、v)药物组合物，其用于治疗由klk-5途径介导的疾病或病症。在一个实施方案中，所述疾病或病症选自：netherton综合征、酒渣鼻、特应性皮炎、银屑病和瘙痒。

125、vi)本发明的化合物，其用于治疗用途。

126、vii)本发明的化合物，其用于治疗由klk-5途径介导的疾病或病症。在一个实施方案中，所述疾病或病症选自下组：netherton综合征、酒渣鼻、特应性皮炎、银屑病和瘙痒。

127、支持性化合物

128、本发明的化合物和中间体已使用以下命名：a)acd/name pro 6.02化学命名软件(advanced chemistry development inc.,toronto,ontario,m5h2l3,canada)；或b)marvinsketch.net.5.11.4(chemaxon kft.záhony u.7,building hx 1031 budapest,hungary)。

129、缩写

130、acn     - 乙腈

131、chaps   - 胆酰胺基丙基)二甲基铵]-1-丙烷磺酸盐)

132、dmap    - n,n-二甲基吡啶-4-胺

133、dmf     - n,n-二甲基甲酰胺

134、dmso    - 二甲亚砜

135、dmap    - 4-二甲基氨基吡啶

136、edc     - 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺

137、es      - 电喷雾

138、gcms    - 气相色谱质谱

139、hplc    - 高压液相色谱

140、ipa     - 异丙醇

141、lcms    - 液相色谱质谱

142、ms      - 质谱

143、rt      - 保留时间

144、sfc     - 超临界流体色谱

145、tfa     - 三氟乙酸

146、thf     - 四氢呋喃

147、uplc    - 超高效液相色谱

148、lcms方法

149、方法1：

150、使用以下洗脱梯度0-3分钟，用0.1％甲酸的水溶液(溶剂a)和0.1％甲酸的乙腈溶液(溶剂b)洗脱在x-select csh c18 xp柱(2.5μm30x4.6毫米内径)上进行分析型hplc：5％-100％b，3-4分钟100％b，在40℃下流速为1.8ml/min。在waters zq质谱仪上(扫描200-900uma)使用电喷雾正电离[es+以产生mh+分子离子]或电喷雾负电离[es-以产生(m-h)-分子离子)模式以20v锥形电压记录质谱(ms)。

151、方法2：

152、使用以下洗脱梯度0-6分钟，用0.1％甲酸的水溶液(溶剂a)和0.1％甲酸的乙腈溶液(溶剂b)洗脱在x-select csh c18 xp柱(2.5μm30x4.6毫米内径)上进行分析型hplc：5％-100％ b，6-7分钟100％b，在40℃下流速为1.8ml/min。在waters zq质谱仪上(扫描200-900uma)使用电喷雾正电离[es+以产生mh+分子离子]或电喷雾负电离[es-以产生(m-h)-分子离子)模式以20v锥形电压记录质谱(ms)。

153、

154、

155、gcms方法

156、

157、uplc/hplc方法

158、

159、手性hplc/sfc方法

160、

161、支持性化合物/中间体

162、在随后的步骤中，在每种起始原料之后，典型地提供对中间体的参考。这仅是为了向熟练的化学家提供帮助。起始原料并不一定由所涉及的批次制备。

163、化合物1

164、4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄脒盐酸盐

165、

166、在密封管中，将4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄脒(中间体1，150mg，0.354mmol)溶于乙醇(20ml)中并冷却至-78℃。将氯化氢(g)缓慢鼓泡通过该溶液10分钟。使反应升至环境温度，并在该温度下放置过夜。使用加热至30℃的水浴在减压下浓缩所得溶液。将亚氨酸酯溶于甲醇氨(7n，过量)中，并在密封管中搅拌过夜。减压浓缩反应物，并将残余物溶于水、甲醇和乙酸乙酯中以消除副产物。将残留的白色粉末溶于盐酸(1m)中并减压浓缩。将残余物在40℃和减压下干燥3小时以得到标题化合物(20mg)。1h nmr(d6-dmso):δh 9.26(s,2h),9.12(s,2h),8.91(s,1h),8.78(d,j＝4.6hz,1h),8.31(d,j＝7.2hz,1h),8.08(s,1h),7.80(d,j＝6.6hz,2h),7.59(d,j＝8.0hz,1h),7.49(m,2h),7.29(d,j＝8.0hz,1h),5.41(m,3h),3.27(m,1h),3.18(m,1h).lcms:保留时间1.59min,mh+442(方法1)。

167、中间体1

168、4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈

169、

170、在密封管中，将4-(2-(2-溴-4-(三氟甲基)苯基)-1-羟乙基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈(中间体2,200mg,0.419mmol)，5,5,5',5'-四甲基-2,2'-二(1,3,2-二氧硼杂)(284mg,1.257mmol)和pdcl2(dppf)(3.68mg,5.03μmol)混合在1,4-二恶烷(15ml)中。将该悬浮液脱气并用氮气回填。添加乙酸钾(82mg，0.838mmol)，将反应容器密封并在微波辐射下加热至130℃，持续25分钟。将反应混合物通过celite床过滤，并将滤液真空浓缩。将残余物直接上样到40g硅胶柱上，并用环己烷中的0-30％(乙酸乙酯/乙醇3:1)洗脱。合并适当的部分并减压浓缩。将残余物溶于乙腈中并过滤以得到白色固体状标题化合物(150mg)。1hnmr(d6-dmso)includes:δh 9.15(s,1h),8.74(d,j＝1.7hz,1h),8.60(dd,j＝4.7hz,j＝1.5hz,1h),8.06(s,1h),7.93(dt,j＝7.8hz,j＝1.9hzx2,1h),7.80(m,2h),7.56(m,1h),7.48(m,2h),7.26(d,j＝8.0hz,1h),5.38(m,3h),3.25(m,1h).lcms:保留时间2.46min,mh+425(方法1)。

171、中间体2

172、4-(2-(2-溴-4-(三氟甲基)苯基)-1-羟乙基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈

173、

174、向4-(2-(2-溴-4-(三氟甲基)苯基)乙酰基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈(中间体3,480mg,1.010mmol)的乙醇溶液中添加硼氢化钠(38.2mg,1.01mmol)，并将反应在20℃搅拌1h。用盐酸(1m)淬灭实验。将混合物在环境温度下搅拌5分钟，然后添加氢氧化钠溶液(1m)直至ph达到8。将所得溶液用乙酸乙酯萃取，将有机相用硫酸钠干燥并过滤。将滤液真空浓缩。将残余物上样到40g硅胶柱上，并用环己烷中的0-30％(乙酸乙酯/乙醇3:1)梯度洗脱。合并适当的级分并真空浓缩以得到霜状固体的标题化合物(200mg)。1h nmr(d6-dmso):δh 8.72(d,j＝1.7hz,1h),8.59(dd,j＝4.8hz,j＝1.6hz,1h),7.98(s,1h),7.91(dt,j＝7.9hz,j＝1.9hz x2,1h),7.71(m,2h),7.53(d,j＝8.0hz,1h),7.48(dd,j＝7.9hz,j＝4.8hz,1h),7.33(s,1h),7.08(d,j＝8.0hz,1h),5.77(d,j＝5.1hz,1h),5.35(d,j＝11.8hz,1h),5.28(d,j＝12.0hz,1h),3.08(m,2h).lcms:保留时间2.55min,mh+477/479(方法1)。

175、中间体3

176、4-(2-(2-溴-4-(三氟甲基)苯基)-乙酰基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈

177、

178、该反应在两个相等电荷的密封管中进行(每管中450mg 4-乙酰基-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈)。将2-溴-1-碘-4-(三氟甲基)苯(1391mg，3.57mmol)、4-乙酰基-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈(中间体4，900mg，3.57mmol)、呫吨(74.3mg，0.128mmol)、pd2(dba)3(49.0mg，0.054mmol)和叔丁醇钠(1029mg，10.70mmol)在干燥的1,4-二恶烷(8ml)中的溶液在biotage initiator微波中在80℃下加热60分钟。将反应过滤并将滤液减压浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯，并用水洗涤。有机相经硫酸钠干燥并过滤。将滤液真空浓缩。将残余物负载到80g硅胶柱上，并用环己烷中的0-20％(乙酸乙酯/乙醇3:1)梯度洗脱。合并适当的级分并真空浓缩以得到霜状固体的标题化合物(510mg)。1h nmr(d6-dmso):δh 8.75(s,1h),8.60(d,j＝3.8hz,1h),8.03(m,2h),7.94(m,2h),7.86(d,j＝8.0hz,1h),7.80(d,j＝7.6hz,1h),7.66(d,j＝7.8hz,1h),7.49(dd,j＝7.6hz,j＝4.9hz,1h),5.49(s,2h),4.80(s,2h).lcms:保留时间2.71min,mh+475/477(方法1).

179、中间体4

180、4-乙酰基-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈

181、

182、将4-乙酰基-2-羟基苄腈(中间体5，1000mg，6.21mmol)添加到吡啶3-基甲醇(745mg，6.83mmol)、三苯膦(2441mg，9.31mmol)和(e)-双(2-甲氧基乙基)二氮杂1,2-二羧酸酯(2180mg，9.31mmol)中。将反应在20℃下搅拌3天。将反应混合物真空浓缩，将残余物溶于乙酸乙酯，并用氢氧化钠溶液(1n)和水洗涤。有机相经硫酸钠干燥并过滤。将滤液真空浓缩，并将残余物负载到80g硅胶柱上，并用环己烷中的0-20％(乙酸乙酯/乙醇3:1)梯度洗脱。合并适当的级分并真空浓缩以得到白色固体状标题化合物(900mg)。1h nmr(d6-dmso):δh 8.74(s,1h),8.60(d,j＝3.4hz,1h),7.95(m,2h),7.79(s,1h),7.70(d,j＝8.0hz,1h),7.49(dd,j＝7.7hz,j＝4.8hz,1h),5.45(s,2h),2.66(s,3h).lcms:保留时间1.48min,mh+253(方法1)。

183、中间体5

184、4-乙酰基-2-羟基苄腈

185、

186、在惰性条件下，将三水合亚铁氰化钾(1.179g，2.79mmol)和碳酸钠(1.971g，18.60mmol)研磨成细粉，并在60℃的真空下干燥3h。向烧瓶中装入1-(4-溴-3-羟基苯基)乙酮(2g，9.30mmol)、二甲基乙酰胺(20ml，9.30mmol)和亚铁氰化钾/碳酸钠混合物，然后抽真空并充入氮气(x 2)。添加乙酸钯(ii)(0.104g，0.465mmol)，并将反应在140℃加热2h。将反应混合物冷却至环境温度并用乙酸乙酯(20ml)稀释。将得到的浆料过滤并将滤液用乙酸乙酯洗涤。将盐酸(1m)添加到滤液中，并且产物用乙酸乙酯萃取。有机层经硫酸钠干燥并过滤。溶液用木炭处理并通过二氧化硅床过滤以得到黄色溶液。蒸发溶剂，残留的浅黄色固体(1.1g)无需进一步纯化即可用于下一步反应。1h nmr(d6-dmso):δh 11.48(s,1h),7.79(d,j＝8.0hz,1h),7.50(m,2h),2.58(s,3h).lcms:保留时间1.73min,mh+160(方法1)。

187、化合物2

188、(r)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄脒盐酸盐

189、

190、在惰性气氛下在0℃下向搅拌的(r)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄脒(化合物3，21g，47.51mmol)的甲醇(42ml)溶液中添加4n hcl的甲醇溶液(42ml)(观察到澄清溶液)。搅拌30分钟后，减压蒸发甲醇，并将残余物冷冻干燥9天。将残余物在乙腈(200ml)中搅拌24小时，并通过过滤分离固体。将固体溶于甲醇(50ml)中，并缓慢加入乙醚(800ml)。通过过滤分离固体，并冷冻干燥48小时以得到灰白色固体状标题化合物(20.3g；99.4％ee)。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δppm 9.25(br s,2h；d2o exchangeable),9.16(br s,2h；d2o exchangeable),8.93(s,1h),8.78(d,j＝5.0hz,1h),8.36(d,j＝7.9hz,1h),8.08(s,1h),7.88-7.75(m,2h),7.58(d,j＝7.7hz,1h),7.52-7.44(m,2h),7.28(d,j＝7.9hz,1h),5.45-5.34(m,3h),3.33-3.23(m,1h),3.21-3.11(m,1h).lcms(esi):保留时间2.45min,mh+442；99.3％(方法n)。uplc:保留时间3.56min,98.90％(方法c)。手性hplc:保留时间3.77min,99.71％(方法c)。sor＝+80.42(c＝0.5，meoh中)。

191、化合物3

192、(r)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄脒

193、

194、在0℃下将新鲜制备的氨的甲醇溶液(溶液中约7m；1.5l)添加到粗制(r)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苯甲亚胺酸甲酯(中间体6，50g)中。将反应在室温搅拌。24小时后，加入氨的甲醇溶液(500ml)，并在室温下搅拌48小时。通过过滤分离固体，用氨的甲醇溶液(300ml)洗涤，并在真空下干燥。将固体溶于水(1l)中并搅拌3小时。滤出固体并真空干燥以得到灰白色固体状标题化合物(21g)。1h nmr(400mhz,dmso-d6；vt-90℃):δppm 8.69(s,1h),8.54–8.53(d,j＝3.5hz,1h),8.04(s,1h),7.86(d,j＝7.9hz,1h),7.71(d,j＝7.0hz,1h),7.51(d,j＝7.9hz,1h),7.47-7.34(m,2h),7.29(s,1h)7.10(d,j＝7.9hz,1h),5.30(dd,j＝10.1,3.7hz,1h),5.21(s,2h),3.19-3.29(m,1h),3.14–3.09(m,1h).lcms(esi):保留时间3.60min；mh+442；95.5％(方法m)。uplc:保留时间3.63min,97.88％(方法c)。

195、中间体6

196、(r)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苯甲亚胺酸甲酯

197、

198、在-10℃下用干燥的hcl气体吹扫搅拌的(r)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈(中间体7，40g，94.33mmol)的甲醇(1.6l)溶液，直到观察到完全饱和(干燥的hcl气体吹扫约9h)。将反应在室温搅拌16小时。将反应溶液在惰性气氛条件下减压(低于约35℃)浓缩，得到浅黄色粘性固体状的粗制标题化合物(50g)，将其直接用于下一步反应。lcms(esi):保留时间1.46min；mh+457；78.2％(方法k)。

199、中间体7

200、(r)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈

201、

202、向搅拌且脱气的(r)-4-(2-(2-溴-4-(三氟甲基)苯基)-1-羟乙基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈(中间体8，125g，0.262mol)和双(新戊基乙二醇基)二硼(296g,1.31mol)的1,4-二恶烷(3.125l,25vol)溶液中依次添加叔丁基二苯基膦(6.48g,26.2mmol)和pd(oac)2(8.82g,13.10mmol)，并且将混合物脱气10分钟。最后添加乙酸钾(103g，1.048mol)并将混合物脱气10分钟。将反应在75℃下搅拌3小时。将反应混合物在乙酸乙酯(2.5l)的帮助下通过celite垫过滤。滤液用水(5x2l)、盐水(2x2l)洗涤，用na2so4干燥，过滤并静置12小时。通过过滤分离沉淀的固体并在真空下干燥以得到85g灰白色固体状标题化合物(96％纯度)。

203、pd-清除剂处理：在65℃下向(r)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈(106g)在3％甲醇在乙酸乙酯(3l)的澄清溶液中添加-dmt(10.6g；0.1w/w)，并在相同温度下搅拌3h。将所得的热非均匀混合物通过celite垫过滤。减压浓缩滤液。将所得残余物在乙腈(1l)中搅拌过夜，将固体通过过滤分离并干燥以得到灰白色固体状标题化合物(85g)。

204、hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm 9.12(s,1h),8.73(s,1h),8.59(d,j＝4.6hz,1h),8.06(s,1h),7.92(d,j＝7.9hz,1h),7.79–7.77(m,2h),7.54(s,1h),7.51-7.44(m,2h),7.26(d,j＝8.1hz,1h),5.42-5.30(m,3h),3.28–3.22(m,1h),3.17–3.09(m,1h).lcms(esi):保留时间1.87min；mh+425；99.63％(方法k)。uplc:99.15％保留时间4.48min(方法c)。手性hplc:99.99％保留时间4.28min(方法b)。

205、中间体8

206、(r)-4-(2-(2-溴-4-(三氟甲基)苯基)-1-羟乙基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈

207、

208、向搅拌的(s)-2-乙酰氧基-2-苯基乙酸(r)-2-(2-溴-4-(三氟甲基)苯基)-1-(4-氰基-3-(吡啶-3-基甲氧基)苯基)乙酯(中间体9，230g，352.2mmol)的甲醇(2.3l)溶液中添加碳酸钾(24.3g，176mmol)，并将反应混合物在35℃下搅拌30分钟。减压蒸发反应溶剂。将残余物溶解在乙酸乙酯(2.5l)中，用水(2l)、盐水(2l)洗涤，用硫酸钠干燥并减压浓缩。将残余物与正戊烷(500ml)一起研磨1h，通过过滤分离固体并在真空下干燥以得到浅黄色固体状标题化合物(155g,92％产率；99.35％ee)。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm8.71(d,j＝1.8hz,1h),8.58(dd,j＝4.7,1.4hz,1h),7.95(s,1h),7.91–7.89(m,1h),7.74-7.65(m,2h),7.52(d,j＝7.9hz,1h),7.48–7.46(m,1h),7.32(s,1h),7.08(d,j＝7.9hz,1h),5.75(br s,1h),5.37-5.25(m,2h),4.93(br s,1h),3.12-3.06(m,2h).lcms(esi):保留时间2.27min；mh+477；98.62％(方法b)。手性hplc:99.67％,保留时间9.13min(方法a)。

209、中间体9

210、(s)-2-乙酰氧基-2-苯基乙酸(r)-2-(2-溴-4-(三氟甲基)苯基)-1-(4-氰基-3-(吡啶-3-基甲氧基)苯基)乙酯

211、

212、在室温下向搅拌的(r)-4-(2-(2-溴-4-(三氟甲基)苯基)-1-羟乙基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈(中间体10，300g，0.628mol)的thf(3l)溶液中添加(s)-(+)-o-乙酰基扁桃酸(220g，1.132mol)、edc.hcl(264g，1.382mol)和dmap(23g，188.6)，并且继续搅拌4小时。将反应用乙酸乙酯(2l)稀释，用水(2x2l)、盐水(2l)洗涤，用无水硫酸钠干燥并减压浓缩。将残余物通过硅胶柱层析(二氧化硅100-200目)纯化，用45％乙酸乙酯的石油醚溶液洗脱以得到浅黄色固体状非对映体混合物(340g)。hplc：61.8％所需非对映异构体(保留时间5.85分钟，方法c)和18.9％其他非对映异构体(保留时间5.74分钟，方法c)。将在异丙醇(10.2l，30倍体积)中的非对映混合物(340g)加热至68℃以得到澄清溶液。然后将溶液冷却至室温，用所需产物(从之前批次获得)接种，并静置18小时。通过过滤分离沉淀的固体，用异丙醇(3x300ml)、正戊烷(3x300ml)洗涤，并在真空下干燥以得到浅黄色固体状非对映体纯的标题化合物(190g)。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δppm 8.73(s,1h),8.61–8.60(m,1h),7.92(d,j＝7.9hz,1h),7.84-7.76(m,2h),7.49(dd,j＝7.7,4.8hz,1h),7.44-7.25(m,8h),7.18(d,j＝7.9hz,1h),6.05–6.03(m,1h),5.94(s,1h),5.42-5.29(m,2h),3.27-3.25(m,2h),2.07(s,3h).lcms(esi):保留时间2.46min,mh+653；97％(方法l)。hplc:95.67％保留时间5.87min(方法c)。

213、中间体10

214、(r)-4-(2-(2-溴-4-(三氟甲基)苯基)-1-羟乙基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈

215、

216、向4-(2-(2-溴-4-(三氟甲基)苯基)乙酰基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈(中间体11，300g，0.632mol)在dmf:异丙醇:h2o(3l:3l:300ml)混合物的搅拌溶液中添加甲酸钾(266g，3.160mol)和rucl[(r,r)-tsdpen]均三甲苯(7.08g，11.39mmol)，并将反应在室温在氮气气氛下搅拌16小时。减压除去异丙醇。将所得反应混合物倒入冰冷的水中。通过过滤分离得到的胶状固体，用冷水(6x1l)洗涤并干燥。将得到的游离固体用戊烷中的10％乙醚洗涤(3x400ml)并干燥以得到黄色固体状标题化合物(300g,99％产率；69.27％ee)。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δppm 8.71(d,j＝1.8hz,1h),8.58(dd,j＝4.7,1.4hz,1h),7.95(s,1h),7.91–7.89(m,1h),7.74-7.65(m,2h),7.52(d,j＝7.9hz,1h),7.48–7.46(m,1h),7.32(s,1h),7.08(d,j＝7.9hz,1h),5.75(br s,1h),5.37-5.25(m,2h),4.93(br s,1h),3.12-3.06(m,2h).lcms(esi):保留时间2.21min；mh+477,93.1％(方法b)。手性hplc:保留时间16.4min；84.54％(方法a)。

217、中间体11

218、4-(2-(2-溴-4-(三氟甲基)苯基)乙酰基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈

219、

220、向4-乙酰基-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈(中间体12，70g，278mmol)和2-溴-1-碘-4-(三氟甲基)苯(116.3g，333mmol)在1,4-二恶烷(1.05l)中的搅拌溶液中添加碳酸铯(181g，556mmol)，并将混合物脱气10分钟。向其中添加呫吨(8.64g，16.7mmol)，并将混合物脱气10分钟。添加pd2(dba)3(7.63g,8.33mmol)，并将混合物脱气10分钟。将反应混合物在90℃加热4小时。通过celite垫过滤反应混合物并用乙酸乙酯(200ml)洗涤。将滤液用水(200ml)稀释，并用乙酸乙酯(2x1l)萃取。有机相经na2so4干燥并浓缩。通过硅胶柱层析(硅胶100-200目)纯化得到的粗产物，用石油醚中的40％乙酸乙酯洗脱以得到黄色固体(55g)。向4-乙酰基-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈(中间体12，350g，1.38mol)和2-溴-1-碘-4-(三氟甲基)苯(581.6g，1.66mol)在1,4-二恶烷(5.25l)中的搅拌溶液中添加碳酸铯(905.2g，2.77mol)，并将混合物脱气10分钟。向其中添加呫吨(43.2g，83.3mmol)，并将混合物脱气10分钟。添加pd2(dba)3(38.1g，41.6mmol)，并将混合物脱气10分钟。将反应混合物在90℃加热4小时。将反应混合物通过celite垫过滤，并用乙酸乙酯(3l)洗涤。将滤液用水(2l)稀释，并用乙酸乙酯(2x 4l)萃取。合并的有机层经无水na2so4干燥并在真空下浓缩。通过硅胶柱层析(硅胶100-200目)纯化得到的粗产物，用石油醚中的40％乙酸乙酯洗脱以得到黄色固体(325g)。将固体合并并用二乙醚(500ml)洗涤以得到浅黄色固体状标题化合物(370g，46％的合并产率)。

221、1hnmr(400mhz,cdcl3):δppm 8.71(d,j＝1.8hz,1h),8.63(dd,j＝4.7,1.2hz,1h),7.92-7.83(m,2h),7.78-7.75(m,1h),7.73-7.69(m,1h),7.67(s,1h),7.58(d,j＝7.9hz,1h),7.40-7.34(m,2h),5.30(s,2h),4.49(s,2h)；lcms(esi):保留时间2.25min,mh+475,99.1％(方法k)。

222、中间体12

223、4-乙酰基-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈

224、

225、在0℃下在30分钟内向氢化钠(矿物油中60％；215g，5.36mol)在dmf(3l)中的搅拌的悬浮液中滴加吡啶-3-基甲醇(627ml，6.44mol)。将所得混合物在室温下搅拌30分钟。在0℃下向该混合物滴加4-乙酰基-2-氟苄腈(中间体13，350g，2.15mol)在dmf(500ml)中的溶液。然后将反应在室温下搅拌3小时。添加冷水(7l)。通过过滤分离形成的固体，用乙醚(2.5l)洗涤并且真空干燥以得到浅棕色固体状标题化合物(450g)，其无需进一步纯化即可直接用于下一步反应。

226、1h nmr(400mhz,cdcl3):δppm 8.71(s,1h),8.63–8.62(m,1h),7.89–7.87(m,1h),7.72(d,j＝7.9hz,1h),7.64(s,1h),7.61–7.59(m,1h),7.38–7.36(m,1h),5.29(s,2h),2.63(s,3h).lcms(esi):保留时间1.78min,mh+253,76％(方法j)。

227、中间体13

228、4-乙酰基-2-氟苄腈

229、

230、向高压釜中搅拌的1-(4-溴-3-氟苯基)乙-1-酮(450g，2.07mol)的dmf(3.6l)溶液中依次添加氰化锌(607.5g，5.18mol)和四甲基乙二胺(tmeda，342ml，2.07mol)，并将混合物用氩气脱气10分钟。向其中添加pd2(dba)3(56.7g,62.1mmol)和呫吨(36g，62.1mmol)，并再次用氩气脱气10分钟。将反应混合物加热至120℃并搅拌4h。通过celite垫过滤反应。将滤液用水(6l)稀释，并用乙酸乙酯(2x5l)萃取。合并的有机层用盐水(2l)洗涤，并减压浓缩以得到棕色胶状物粗产物。向高压釜中的1-(4-溴-3-氟苯基)乙-1-酮(430g，1.98mol)在dmf(3.44l)中的搅拌溶液中添加氰化锌(580.6g，4.95mol)和四甲基乙二胺(tmeda,327ml,1.98mol)，并将混合物用氩气脱气10分钟。向其中加入pd2(dba)3(54.2g，59.4mmol)和呫吨(34.4g，59.4mmol)，并将混合物再次用氩气脱气。将反应混合物加热至120℃并搅拌4h。通过celite垫过滤反应。将滤液用冷水(5l)稀释，并用乙酸乙酯(2x3l)萃取。合并的有机层用盐水(1.5l)洗涤，经硫酸钠干燥并减压浓缩以得到粗产物。

231、合并来自两个批次的粗物质，并通过硅胶柱层析(二氧化硅100-200目)纯化，用石油醚中的乙酸乙酯(25-50％乙酸乙酯)梯度洗脱以得到黄色固体状标题化合物(630g，94％)。

232、1hnmr(400mhz,cdcl3):δppm 7.84-7.80(m,1h),7.79-7.73(m,2h),2.64(s,3h).gcms:保留时间7.33min,m+163,92％(方法a)。

233、中间体14

234、1-(4-溴-3-氟苯基)乙-1-酮

235、

236、在0℃下向搅拌的4-溴-3-氟-n-甲氧基-n-甲基苯甲酰胺(中间体15，1.17kg，4.46mol)的thf(11.7l)溶液中滴加memgcl(在thf中3m溶液；2.53l，7.59mol)。将反应在室温下搅拌2h。通过滴加饱和氯化铵溶液(200ml)将反应混合物淬灭。将所得溶液用水(6l)稀释，并用乙酸乙酯(2x5l)萃取。合并的有机层经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。残余物通过硅胶柱层析(硅胶100-200目)纯化，用石油醚中的8％乙酸乙酯洗脱以得到浅黄色固体状标题化合物(890g，91.8％)。1hnmr(400mhz,cdcl3):δppm 7.72-7.65(m,2h),7.63-7.59(m,1h),2.59(s,3h)。gcms:保留时间7.38min,m+216,96％(方法a)。

237、中间体15

238、4-溴-3-氟-n-甲氧基-n-甲基苯甲酰胺

239、

240、在0℃下向搅拌的4-溴-3-氟苯甲酸(1.0kg，4.566mol)的二氯甲烷(5l)溶液中加入草酰氯(587.2ml，6.849mol)，然后逐滴添加干燥dmf(20ml,0.02vol)。将反应在室温搅拌3小时。在减压和氩气氛下蒸发反应溶剂以得到黄色液体(1.08kg)，将其直接用于下一步反应。在0℃下向搅拌的n,o-二甲基羟胺盐酸盐(0.532kg，5.46mol)的二氯甲烷(10l)溶液中添加三乙胺(2.53l，18.19mol)，并将反应搅拌15分钟。向该混合物中滴加上述制备的液体(1.08kg)的二氯甲烷(1l)溶液。将反应在室温搅拌2h。用水(4l)稀释反应混合物，并用二氯甲烷(2x4l)萃取。合并的有机萃取物用1n盐酸(5l)洗涤，然后用饱和nahco3溶液(5l)洗涤，用无水硫酸钠干燥并减压浓缩以得到浅棕色液体状标题化合物(1.17kg，98％)，其无需进一步纯化即可使用。1h nmr(400mhz,cdcl3):δppm 7.61–7.59(m,1h),7.51–7.49(m,1h),7.42–7.40(m,1h),3.55(s,3h),3.36(s,3h)；lcms(esi):保留时间3.29min,mh+262,93.3％(方法i)。

241、化合物2(替代制备)

242、(r)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄脒盐酸盐

243、

244、在0℃下向搅拌的(r)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄脒(化合物3，1.7g，3.85mmol)的甲醇(5ml)溶液中添加甲醇(4ml)中的3n hcl，并搅拌20分钟。在25℃减压蒸发溶剂。将残余物溶于milliq超纯水(5ml)中并通过冻干干燥。由于残留的甲酸，重复形成盐以得到灰白色固体状标题化合物(1.745g，100％)。lcms(esi):保留时间1.99min,mh+442；99.5％(方法a)。手性hplc:保留时间3.67min,e.e.99.85％(方法c)。

245、化合物3(替代制备)

246、(r)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄脒

247、

248、在0℃下向(r)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈(中间体6，2.6g，5.70mmol)添加甲醇氨(150ml)。将反应在室温搅拌24小时。将反应溶液在氮气氛下在25℃下浓缩。将残留物通过制备型hplc纯化(柱：atlantis t3 c18(250x19mm,5μ，洗脱液：0.1％甲酸水溶液(a)/乙腈(b)，梯度：0/10,10/45,12.2/45,13/100,16/100,16.5/10,20/10，流速：18ml/min)以得到白色固体状标题化合物(1.7g,63％)。lcms(esi):保留时间：1.99min；mh+442；99.1％(方法o)。

249、中间体6(替代制备)

250、(r)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苯甲亚胺酸甲酯

251、

252、在-10℃下用hcl气体饱和搅拌的(r)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈(中间体7，2.5g，5.89mmol)的甲醇(1.6l)溶液。将反应在室温搅拌24小时。将反应溶液在减压和氩气氛下在25℃下浓缩以得到浅黄色粘性固体状粗品标题化合物(2.7g)，将其直接用于下一步反应。

253、lcms(esi):保留时间2.06min；mh+457；78％(方法o)。

254、中间体7(替代制备)

255、(r)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈

256、

257、向搅拌的4-(2-(2-溴-4-(三氟甲基)苯基)-1-羟乙基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈(中间体2，5g，10.47mmol)的1,4-二恶烷(150ml)溶液中添加叔丁基二苯膦(253mg，1.04mmol)，并将混合物脱气。添加pd(oac)2(352mg,0.52mmol)，并将混合物脱气。添加双(新戊基乙二醇基)二硼(11.78g，52.38mmol)，并将混合物脱气。最后，加入乙酸钾(4.11g，41.9mmol)，并将混合物脱气。将反应在75℃下在密封管中搅拌2h。将反应混合物通过celite垫过滤，用木炭处理并通过celite过滤。滤液用水(5x2l)、盐水(2x50ml)洗涤，用na2so4干燥并浓缩以得到灰白色固体状外消旋化合物(5.2g)。

258、将该物质与另外8.0g类似制备的粗品外消旋化合物混合。将合并的样品用乙醚洗涤，通过过滤分离并干燥(6.13g)。

259、将2种对映体通过手性sfc分离(柱：chiralcel od-h 280x4.6mm，5μ，溶剂co275％，30mm甲醇氨25％，流速：3.0g/min，背压：100bar，温度：30℃，紫外检测210nm)。通过在真空下于20℃蒸馏分离样品。

260、峰1：(r)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈，灰白色固体(2.5g)，lcms保留时间2.74min；mh+425；78％(方法o)；手性hplc保留时间4.27min,99.9％e.e(方法d)。峰2：(s)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈，灰白色固体(2.5g)，lcms保留时间2.73min；mh+425；78％(方法o)；手性hplc保留时间6.19min,98.9％e.e(方法d)。

261、化合物4-8(参见表)使用通用反应方案1-12制备。化合物4-8还可以使用由相应的起始材料制备化合物1-3所述的方法(或与那些相似的方法)来制备。

262、例如，化合物4可以以与化合物3(替代制备)类似的方式由(s)-4-(1-羟基-7-(三氟甲基)-3,4-二氢-1h-苯并[c][1,2]氧杂硼杂环已-3-基)-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈[参见中间体7的制备(替代制备)]来制备。

263、例如，在中间体3的制备中，可用4-乙酰基-2-(3-氯苯酰氧基)苄腈代替4-乙酰基-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈，以类似于化合物1的方式制备化合物5。

264、例如，在中间体3的制备中，可用4-乙酰苄腈代替4-乙酰基-2-(吡啶-3-基甲氧基)苄腈，以类似于化合物1的方式制备化合物6。

265、例如，在中间体3的制备中，可用2-溴-5-氯-4-氟-1-碘苯代替2-溴-1-碘-4-(三氟甲基)苯，以类似于化合物1的方式制备化合物7。

266、例如，在中间体3的制备中，可用2-溴-1-碘苯代替2-溴-1-碘-4-(三氟甲基)苯，以类似于化合物1的方式制备化合物8。

267、反应条件/反应时间和后处理程序的任何必要变化对于熟练的化学家而言都是熟悉的。除另有说明外，表中化合物为对映异构体的外消旋混合物。

268、表

269、

270、生物学测定

271、klk5蛋白的制备

272、使用bac-to-bac系统(invitrogen)(pfastbac_hklk5_6his-q-flag)从重组杆状病毒产生重组klk5蛋白，该蛋白在5l草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)super 9昆虫细胞中表达，病毒感染率为1.0。该蛋白质被分泌到hyclone sfx生长培养基(ge healthcare)中，并在5ml histrap excel柱(ge healthcare)上从中将其提取。该柱用500mm nacl，20mmtris ph 7.4缓冲液洗涤，并用250mm nacl中500mm咪唑，20mm tris ph7.4缓冲液洗脱蛋白质。将洗脱液捕获于5ml anti-flag m2 affinity gel色谱柱(sigma)上。通过在50mmnacl，20mm tris-hcl ph 7.4缓冲液中与0.2mg/ml flag肽(sigma)竞争结合蛋白来洗脱klk5。将1m cacl2添加到合并的级分中至终浓度为2mm，并用每μg目标蛋白0.1u肠激酶(novagen)处理。将蛋白质在室温下孵育约48小时。然后将裂解的蛋白质在1ml肝素hphitrap色谱柱(ge healthcare)上在20mm mops，ph 6.8缓冲液中进一步纯化，用20mm mops中的100mm nacl，ph 6.8缓冲液中洗涤，并在该缓冲液中用700mm nacl洗脱。合并包含klk5的级分并使用截留分子量为10000da的amicon浓缩器浓缩。对于冷冻保护，添加甘油至终浓度为50％。所有纯化均使用ge healthcare的半自动系统进行。

273、动力学flint klk5测定

274、在dmso中制备每种支持性化合物的11点，3倍系列稀释液，并使用echo 555声学分配器(labcyte,sunnyvale,ca)将50nl这些溶液分配到黑色lv 384孔板(greiner bio-one,stonehouse,uk)。在5μl最终测定体积中，最终测定浓度范围为10μm-0.5nm。将50nl dmso分别分配到第6和第18列中，分别用于高和低对照。将测定板密封并在4℃下储存直至需要。

275、用于测定人激肽释放酶5重组酶(klk5)的条件为100mm磷酸钠，ph 8，1mm chaps，7.5nm klk5酶(参见上文制备)，9um肽底物(tos-gly-pro-arg)2[r110].2tfa)，总反应体积为5μl。

276、首先将2.5μl酶溶液(磷酸钠中的15nm klk5，ph 8，1mm chaps)分配到测定板的所有孔中(第18列除外)，然后将2.5μl缓冲液分配到第18列(以产生低对照)来进行测定。通过向所有孔中添加2.5μl底物[18um(tos-gly-pro-arg)2[r110].2tfa(cambridge researchbiochemicals)的磷酸钠溶液，ph 8，1mm chaps]来引发反应。将板立即离心至1000rpm，然后转移至阅读器。所有添加均使用multidrop combi分配器(thermo fisher scientific)进行。将测定板转移至perkin elmer viewlux。在用klk5裂解底物之后，将板在485nm下激发，并在535nm下测量若丹明110荧光发射率。在5分钟内以30秒的读取间隔进行十次测量。

277、数据分析

278、数据分析在activitybase(id business solutions ltd,surrey,uk)中进行。

279、根据原始数据，将酶反应速率计算为相对荧光单位(rfu)。使用每孔收集的10个读数，通过数据拟合直线。从反应进程曲线的斜率计算初始速率。将速率数据标准化为第6列的高对照(0％抑制)和第18列的低对照(100％抑制)之间的％抑制。使用idbs主模块拟合拟合剂量响应曲线。数据通过四参数拟合逻辑拟合：

280、

281、其中x为抑制剂浓度，y为抑制(％)，a为最小响应，d为最大响应，c为曲线的ic50，b为hill斜率。–log(ic50)提供pic50。

282、在以上测定中测试了所有支持性化合物。每个化合物测试一次以上。每种化合物的平均pic50如下：

283、化合物1提供8.5的pic50。

284、化合物2提供8.4的pic50。

285、化合物3提供7.4的pic50。

286、化合物4提供8.4的pic50。

287、化合物5提供8.1的pic50。

288、化合物6提供8.0的pic50。

289、化合物7提供8.1的pic50。

290、化合物8提供8.2的pic50。

技术实现思路