融合dsRNA及其组合在防治蚜虫中的应用

本发明属于生物，涉及蚜虫防治，具体涉及融合dsrna及其组合在防治蚜虫中的应用。

背景技术：

1、蚜虫隶属半翅目(hemiptera)蚜科(aphididae)，主要分布在北半球的温带及亚热带地区，是重要的农林害虫类群之一，极具破坏性，且具有体型小、寄主繁多、适应能力和繁殖力极强等特点。蚜虫为刺吸式口器昆虫，在刺吸作物汁液的同时还分泌蜜露黏着于叶片表面，阻碍植物光合作用，并促进霉菌滋生诱发煤污病。同时蚜虫还能够传播植物病毒，因此造成的损失比蚜虫直接为害作物导致的产量损失更加严重。

2、桃蚜(myzuspersicae)作为广食性昆虫，食性杂，寄主植物多达400多余种，具有生活周期短、繁殖率高、环境适应性强等特点。其主要以成蚜和若蚜聚集在植物的幼芽、叶片和嫩梢上刺吸汁液为害。同时，桃蚜还传播了如黄瓜花叶病毒(cmv)、马铃薯y病毒(pvy)和番木瓜环斑病毒(prsv)等110多种重要的植物病毒，给世界农业造成巨大的经济损失。目前对于桃蚜的防治主要以化学防治为主，但农药的不合理使用造成了严重的“3r”问题，严重威胁着人类的生活质量和身体健康。随着全球气候变暖和农作物栽培方式的改变，单一的化学防治已不能满足人们对粮食安全的要求，寻找更加绿色有效地防治手段迫在眉睫。

3、rnai(rnainterference)技术被称为“农药史上的第三次革命”，是防治病虫害新型的重要技术手段。rnai绿色防控技术的核心理念是将外源(人为)的dsrna注入昆虫体内抑制靶标基因的表达，导致害虫的生长发育障碍或死亡，从而降低有害生物对农作物的侵害，实现病虫害防治。rnai技术在防治病虫害上具有防治目标专一性、靶标开发便捷性、应用便捷、操作简单、绿色无污染等多种优势，符合公众对绿色农药的需求。目前，在研发rnai生物农药领域，已有产品上市。2007年，在玉米内转化表达玉米根萤叶甲(diabroticavirgifera)的一种参与能量代谢的关键蛋白(v-atpase)的dsrna，可以有效减少玉米根萤叶甲对与玉米的危害。仅过了10年，首个商业化的抗虫转基因玉米获得美国环境保护署(u.s.environmental protectionagency，epa)的种植许可，并于2021年获得中国农业农村部转基因安全许可证书。

4、蚜虫取食过程中需应对寄主植物的防御机制，其基因转录具有很强的可塑性，大量取食相关基因的调控表达使得蚜虫可应对因取食诱导的植物防御。在蚜虫rnai靶标中，通过干扰蚜虫取食相关基因，如唾液蛋白基因c002，shp，armet，ace等，可显著降低蚜虫的繁殖力和种群数量。c002首次从豌豆蚜唾液腺中鉴定出是蚜虫连续进食所必需的蛋白。桃蚜的c002基因(mpc002)在烟草中过表达增加了蚜虫在烟草上的繁殖能力；相反,通过rnai降低蚜虫中c002的表达，导致豌豆蚜的致病性和桃蚜的繁殖力降低。并且，蚜虫与天敌、传粉昆虫的食性不同，取食相关基因相比有益昆虫，rnai特异性更强，因此rnai靶向蚜虫取食相关基因不仅可以有效控制蚜虫数量，同时极大降低了对天敌的安全性风险。目前，利用rnai技术防治蚜虫的研究多集中于单个基因，而蚜虫体内存在大量的同源基因，rnai靶向单个基因可能会存在互补效应，导致防治效果差，效率低。这是蚜虫rnai防治中迫切需要解决的问题所在。

技术实现思路

1、本发明针对上述问题，提供一种能显著降低蚜虫存活率和繁殖力的融合dsrna，进而实现防治蚜虫的目的。

2、本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：

3、一种防治蚜虫的融合dsrna，是由靶向蚜虫多个基因的dsrna融合得到的，包括由靶向同一个基因家族中的多个基因的dsrna融合得到的或者靶向蚜虫取食相关蛋白基因的dsrna融合得到的dsrna。本发明中，dsrna片段设计选择基因的保守区域，可靶向多种蚜虫的同源基因(并不局限于桃蚜)，设计出的多个dsrna片段，分析每个dsrna片段的脱靶率，选择对龟纹瓢虫(蚜虫的天敌，在防治天敌方面发挥重要作用)同源基因脱靶率低的区域，以保护龟纹瓢虫，维持田间蚜虫天敌种群。

4、所述基因家族选自细胞骨架蛋白基因、钙离子结合蛋白基因、水解酶基因、过氧化物酶基因、dna结合蛋白基因、锌离子结合蛋白基因、热激蛋白基因中的一个或多个，所述取食相关蛋白包括atp载体蛋白、转录调节蛋白、异柠檬酸脱氢酶亚基α；

5、所述融合dsrna的的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.1～8的任一序列所示，或者所述融合dsrna为seq id no.1～8所述序列的任意组合。

6、上述的融合dsrna的编码基因，如seq id no.1～8所示的融合dsrna的编码基因的核苷酸序列依次为seq id no.10～17所示。

7、上述的融合dsrna或上述的编码基因的下述任一种应用：

8、1)在防治蚜虫中的应用或在制备防治蚜虫产品中的应用；

9、2)在促进蚜虫死亡中的应用或在制备促进蚜虫死亡产品中的应用；

10、3)在抑制蚜虫生长中的应用或在制备抑制蚜虫生长产品中的应用；

11、4)在抑制蚜虫体内融合dsrna对应的基因的表达中的应用，或在制备抑制蚜虫体内融合dsrna对应的基因的表达的产品中的应用。

12、所述应用为将上述的融合dsrna导入蚜虫，实现抑制蚜虫生长、降低蚜虫繁殖力、降低蚜虫存活率，从而实现防治蚜虫。

13、所述融合dsrna的导入方式为用dsrna饲喂蚜虫。

14、将融合dsrna与液体饲料混合至融合dsrna的浓度为800～1200ng/μl后饲喂蚜虫，优选dsrna的浓度为900～1100ng/μl。

15、本发明还提供了含有上述的融合dsrna的重组表达载体、重组菌或者表达盒。

16、本发明还提供了含有上述的融合dsrna的编码基因的重组表达载体、重组菌或者表达盒。

17、本发明最后提供了上述重组表达载体、重组菌或表达盒的下述任一种应用：

18、1)在防治蚜虫中的应用或在制备防治蚜虫产品中的应用；

19、2)在促进蚜虫死亡中的应用或在制备促进蚜虫死亡产品中的应用；

20、3)在抑制蚜虫生长中的应用或在制备抑制蚜虫生长产品中的应用；

21、4)在抑制蚜虫体内融合dsrna对应的基因的表达中的应用，或在制备抑制蚜虫体内融合dsrna对应的基因的表达的产品中的应用。

22、在上述的应用的技术方案中，所述蚜虫为桃蚜。

23、本发明的有益效果是：提供了融合dsrna，每一条融合dsrna都针对靶向对应桃蚜某一功能的多条基因，通过饲喂的方式，桃蚜取食融合dsrna后抑制多条功能相同的基因表达，从而抑制蚜虫生长，死亡率相较于对照组大大提高，产蚜量显著降低；且融合dsrna相较于靶向单个基因的dsrna显著提高了桃蚜的死亡率、降低了其繁殖力，有望应用于制备防治桃蚜的生物农药中，减少化学农药的使用，保护环境，减少化学农药的伤害。