一种生物标志物组合及其应用

本发明属于生物医药，尤其涉及一种生物标志物组合及其应用。

背景技术：

1、阿尔茨海默病(alzheimerdisease，ad)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，但病因迄今未明。65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。患者通常在症状出现后可存活8至10年，但疾病的病程可以为1至25年。通常由肺炎、营养不良或一般身体消耗(活动)引起死亡。2015年，全球痴呆患者人数已达4680万人，其中50％-75％为阿尔茨海默病患者，有约990万例新发痴呆患者将被诊断，平均每3秒新增1人，预计到2050年将达1.31亿人。研究表明，老年性痴呆是继肿瘤、心脏病、脑血管病之后引起老年人死亡的第四大病因，花费在所有疾病中排第三位。随着我国人口的老龄化，阿尔茨海默病患者持续增加。目前，我国大约有600万患者，数量居全球之首，而且每年平均有30万新发病例，也是全球增速最快的国家之一。阿尔茨海默病可能是一组异质性疾病，涉及很多因素，如遗传、外伤、病毒感染、其他疾病等等，但其发病机制尚不清楚，其中一个主要机制为β分泌酶l(β-site amyloidprecursorprotein-cleavingenzyme，bace1)裂解淀粉样前蛋白(amyloidprecursorprotein，app)形成的淀粉样斑块在神经元聚集，打破了aβ42/aβ40的平衡状态，产生神经毒性。

2、ad与其他类型的痴呆，如血管性痴呆(vad)、帕金森病性痴呆(pdd)、行为变异性额颞叶痴呆(bvftd)、路易体痴呆(dlb)等，可能存在重叠的临床表现、病理和生物标志物，所以往往导致临床诊断困难。

3、基于上述问题，ad的临床治疗急需一种可高效、准确诊断ad的方法。

技术实现思路

1、本发明提供了一种生物标志物组合，所述生物标志物组合由loc653658、clc、rpl26和rpl31四个生物标志物组成，使用所述生物标志物组合诊断诊断阿尔茨海默病的roc曲线图中，auc值可达0.800以上，检测准确率非常高。

2、本发明还提供了所述生物标志物组合的检测试剂在制备诊断阿尔茨海默病产品中的应用。

3、在本发明中，术语“生物标志物”意指化合物，优选是基因，与来自具有第二表型(例如没有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品相比，它在来自具有第一表型(例如患有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品中差异地存在(即增加或减少)。术语“生物标志物”通常是指一种基因的存在/浓度/含量或两种或更多种基因的存在/浓度/含量。

4、术语“受试者”意指任何动物，还指人类和非人类的动物。术语“非人类的动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等。

5、生物标志物可以在任何水平上差异地存在，但是一般以如下的水平存在，所述水平增加了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、或更多；或一般以如下的水平存在，所述水平减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％(即不存在)。

6、优选地，生物标志物以具有统计显著性(即p值小于0.05和/或q值小于0.10，如使用韦尔奇氏t检验(welch's t-test)或wilcoxon秩和检验(wilcoxon's rank-sum test)所确定的水平差异地存在。

7、进一步的，所述试剂包括引物、探针、抗体。

8、术语“引物”指的是能够形成与模板链互补的碱基对(base pair)，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7个～50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。

9、术语“核酸”泛指：染色体的段；dna、cdna和/或rna的段或部分。核酸可以自最初与任何源分离的核酸样本(例如，与样本dna或rna分离、从样本dna或rna纯化、扩增、克隆或逆转录)获取或获得。

10、术语“探针”指的是能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

11、本发明还提供了一种诊断阿尔茨海默病的产品，所述产品包括检测样本中前面所述生物标志物组合基因表达水平的试剂。

12、进一步的，所述产品包括试剂盒、芯片或试纸条。

13、进一步的，所述试剂包括通过pcr、原位杂交、芯片、高通量测序平台或免疫法检测所述生物标志物组合的表达水平的试剂，优选地，所述的pcr包括逆转录pcr或实时定量pcr。

14、在本发明中，试剂盒还包括容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂，以及附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对疾病发展进行判断、对治疗方案进行选择。

15、本发明所述的试剂盒可包含适于实用(如针对于不同的检测方法)的多种不同的试剂，并不限于目前所列举的试剂，只要是基于前面所述的生物标志物组合的检测来诊断阿尔茨海默病的试剂均包含在本发明范围内。

16、进一步的，所述产品还包括处理样本的试剂。

17、本发明还提供了一种所述生物标志物组合在构建预测阿尔茨海默病计算模型或者嵌入了所述计算模型的系统中的应用；所述计算模型以生物标志物表达水平作为输入变量，通过生物信息学方法进行运算，最后输出疾病的风险概率。

18、正如熟练技术人员知道的，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合标志物和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

19、优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于阿尔茨海默病的风险或与有助于评估阿尔茨海默病患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有阿尔茨海默病风险的个体、具有阿尔茨海默病的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

20、用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(da)(即线性、二次、规则da)、kernel方法(即svm)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、pls(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、cart、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即simca)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。

21、进一步的，所述嵌入了计算模型的系统包括：阿尔茨海默病评估装置和彼此通信地连接的信息通信终端装置；所述阿尔茨海默病评估装置包括控制单元和存储单元，用于评估受试者是否患有阿尔茨海默病；所述彼此通信地连接的信息通信终端装置提供关于来自受试者样本中权利要求1所述生物标志物组合基因表达水平的数据；所述阿尔茨海默病评估装置的控制单元包括：

22、1)数据接收单元，其接收从所述信息通信终端设备传输的关于所述样本的前面所述的生物标志物组合的表达水平的数据；

23、2)判别值计算单元，其基于由所述数据接收单元接收的所述样本中前面所述的生物标志物组合的表达水平以及具有存储在所述存储单元中的作为解释变量的前面所述的生物标志物组合的表达水平的判别来计算判别值；

24、3)判别值基准评价单元，其基于由所述判别值计算单元计算的判别值，对所述受试者中的阿尔茨海默病的情况进行评价；以及

25、4)评估结果发送单元，其将由所述判别值基准评估单元获得的所述受试者的评估结果发送到所述信息通信终端装置。

26、本发明还提供了一种所述生物标志物组合在筛选治疗阿尔茨海默病候选药物中的应用。

27、本发明的优点和有益效果如下：

28、(1)本发明首次发现了通过检测loc653658+clc+rpl26+rpl31生物标志物组合表达水平可以预测或诊断受试者是否患有阿尔茨海默病。

29、(2)单独使用loc653658、clc、rpl26、rpl31、loc650276、rps27生物标志物诊断阿尔茨海默病的auc值分别为0.722、0.670、0.755、0.700、0.724和0.701，使用clc+loc650276+rps27+rpl26生物标志物组合诊断阿尔茨海默病的auc值为0.753，而使用本发明中的loc653658+clc+rpl26+rpl31生物标志物组合诊断阿尔茨海默病的auc值可达0.822。显然，本发明中生物标志物组合诊断阿尔茨海默病的auc值要远远高于loc653658、clc、rpl26、rpl31、loc650276、rps27任意单一生物标志物或者其他生物标志物组合，说明本发明中生物标志物组合对阿尔茨海默病的诊断准确率远远高于loc653658、clc、rpl26、rpl31、loc650276、rps27任意单一生物标志物或者其他生物标志物组合，本发明中生物标志物组合在提高阿尔茨海默病诊断准确率方面所取得的技术效果完全超出了本领域的常规预期。

30、(3)其他生物标志物组合，clc+loc650276+rps27+rpl26诊断阿尔茨海默病的auc值只有0.753，要低于其中单一生物标志物rpl26诊断阿尔茨海默病的auc值0.755，即并不是任意生物标志物组合诊断准确率都要高于单一生物标志物，说明本技术中生物标志物组合loc653658+clc+rpl26+rpl31的选择并不是常规调整获得。

31、其中：

32、loc653658在ncbi中的gene id:653658。

33、clc在ncbi中的gene id:1178。

34、rpl26在ncbi中的gene id:6154。

35、rpl31在ncbi中的gene id:6160。

36、loc650276在ncbi中的gene id:650276，也可以称之为rpl7p6，gene id:90193。

37、rps27在ncbi中的gene id:6232。