一种编码通用流感的mRNA疫苗及其用途的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及一种包含编码通用流感的mrna疫苗。此外，本发明还涉及该mrna疫苗在小鼠模型中的应用。

背景技术：

1、流感病毒是一种造成人类或动物患上流行性感冒的rna病毒，会造成急性上呼吸道感染，并借由空气传播极易在世界各地引起周期性的大流行(一般流行于每年冬春季和夏季)。世界卫生组织(who)建议每年接种流感疫苗，这是预防流感的最有效方法。然而由于流感病毒血凝素(ha)常发生抗原漂移和/或抗原转换，造成疫苗毒株的抗原性与流行毒株不匹配，从而导致目前的流感疫苗不能有效预防季节性和大流行性流感。据报道，全球范围内季节性流感疫苗效力仅为10％～60％。因此市场迫切需要研发出一款靶向保守流感病毒抗原表位的通用型疫苗。本发明将流感病毒三种保守且具有免疫原性的区域，即基质蛋白m2胞外结构域，血凝素ha茎部结构域，核蛋白np组合在一起，以更加广泛性触发免疫保护效果。

2、当前市面上存在的流感疫苗主要有流感裂解疫苗、流感减毒疫苗、蛋白亚单位疫苗。无论是传统的基于鸡胚生产的流感裂解疫苗，还是基于细胞基质或者重组蛋白方式生产的流感疫苗生产时间均较长。流感相关mrna疫苗的研发可以避开细胞发酵等一系列复杂生物活性过程，只需要体外合成mrna即可，极大程度提高了研发速度，简化了工艺步骤。不管是针对某个流感毒株的特异性疫苗还是通用型疫苗，通过mrna技术都可以将候选流感疫苗快速推进到临床试验阶段。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种包含编码通用流感的mrna疫苗及其应用。

2、具体地，本发明要解决的技术问题之一是提供一种包含编码通用流感的mrna疫苗。

3、本发明要解决的技术问题之二是提供包含编码通用流感的mrna疫苗的制备方法。

4、本发明要解决的技术问题之三是提供包含编码通用流感的mrna疫苗的应用。

5、在本发明的第一方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白从n端到c端具有如下式(i)或(ii)所示的结构：

6、s-m-h-n(i)，

7、s-h-m-n(ii)，

8、式中，

9、“-”各自独立地为键或连接肽；

10、s为无或信号肽；

11、m为无、或n个串联的流感病毒基质蛋白2胞外结构域(m2e)或其免疫原性片段；

12、h为无、或m个串联的血凝素(ha)茎部(lah)区域或其免疫原性片段；

13、n为核蛋白np、或其免疫原性片段；

14、其中，n为1-6的整数；

15、m为1-6的整数，优选为1、2或3；

16、并且m和h不同时为无。

17、在另一优选例中，n为1、2、3或4。

18、在另一优选例中，m为1、2或3。

19、在另一优选例中，所述的信号肽包括组织型纤溶酶原激活剂信号肽、或血清免疫球蛋白e的信号肽、或其组合。

20、在另一优选例中，s具有如seq id no:1第1-23位所示的氨基酸序列。

21、在另一优选例中，所述重组蛋白在细胞中合成时不进入细胞核。

22、在另一优选例中，所述的核蛋白(np)包括：来自pr8毒株的np蛋白，或其同源序列。

23、在另一优选例中，所述的来自pr8毒株的np蛋白是由野生型pr8毒株np蛋白经过一个或多个核定位信号区中的氨基酸突变产生的。

24、在另一优选例中，所述的核定位信号区包括seq id no:10所示序列第2-12位、第197-215位、第339-344位、或其组合。

25、在另一优选例中，所述的突变位于对应于seq id no:10所示序列第6、7、212、213、214、215、341、342位氨基酸、或其组合。

26、在另一优选例中，所述的突变包括选自下组的突变：k6p、r6p、r212p、k213p、r215p、r341p、v342l、或其组合，所述氨基酸位置编号对应于突变后序列seq id no:10的位置编号。

27、在另一优选例中，所述的核蛋白的氨基酸序列选自下组：

28、(n1)如seq id no:10所示的氨基酸序列；

29、(n2)在如seq id no:10所示序列的基础上，进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其n端或c端添加1至30个氨基酸残基，较佳地1-10个氨基酸残基，更佳地1-5个氨基酸残基，从而获得的氨基酸序列；并且所述获得的氨基酸序列与如seq idno:10所示序列具有≥85％(优选地≥90％，更优选地≥95％，例如≥96％、≥97％、≥98％或≥99％)的序列同一性；并且所获得的氨基酸序列与(n1)中的序列具有相同或相似的免疫原性，并且不发生核定位。

30、在另一优选例中，所述的m为n个串联的相同或不同的m2e。

31、在另一优选例中，所述的流感病毒来源于人流感、禽流感、猪流感、或其组合。

32、在另一优选例中，所述的流感病毒为甲型流感病毒。

33、在另一优选例中，所述的m2e的氨基酸序列选自下组：

34、(m1)如seq id no:3-6中任一所示的氨基酸序列；

35、(m2)在如seq id no:3-6中任一所示序列的基础上，进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其n端或c端添加1至3个氨基酸残基，较佳地1-2个氨基酸残基，更佳地1个氨基酸残基，从而获得的氨基酸序列；并且所述获得的氨基酸序列与如seqid no:3-6中任一所示序列具有≥85％(优选地≥90％，更优选地≥95％，例如≥96％、≥97％、≥98％或≥99％)的序列同一性；并且所获得的氨基酸序列与(m1)中的序列具有相同或相似的免疫原性。

36、在另一优选例中，所述的m从n端到c端具有如下式(iii)所示结构：

37、m1-m2-m3-m4(iii)；

38、式中，

39、“-”各自独立地为键或连接肽；

40、m1、m2、m3、和m4各自独立地为无或m2e或其免疫原性片段，且m1、m2、m3、和m4不同时为无。

41、在另一优选例中，m1、m2、m3、和m4的氨基酸序列各自独立地选自下组：seq id no:3、4、5和6。

42、在另一优选例中，m1、m2、m3、和m4序列互不相同。

43、在另一优选例中，m1具有seq id no:3所示氨基酸序列；m2具有seq id no:4所示氨基酸序列；m3具有seq id no:5所示氨基酸序列；m4具有seq id no:6所示氨基酸序列。

44、在另一优选例中，所述的h为m个串联的相同或不同的血凝素茎部lah区域。

45、在另一优选例中，所述的ha茎部lah区域包括：来自h1、h3、h5亚型甲型流感病毒ha2上的长α螺旋区域、或其同源序列。

46、在另一优选例中，所述的ha茎部lah区域的氨基酸序列选自下组：

47、(l1)如seq id no:7-9中任一所示的氨基酸序列；

48、(l2)在如seq id no:7-9中任一所示序列的基础上，进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其n端或c端添加1至10个氨基酸残基，较佳地1-5个氨基酸残基，更佳地1-3个氨基酸残基，从而获得的氨基酸序列；并且所述获得的氨基酸序列与如seq id no:7-9中任一所示序列具有≥85％(优选地≥90％，更优选地≥95％，例如≥96％、≥97％、≥98％或≥99％)的序列同一性；并且所获得的氨基酸序列与(l1)中的序列具有相同或相似的免疫原性。

49、在另一优选例中，所述的h从n端到c端具有如下式(iv)所示结构：

50、h1-h2-h3(iv)；

51、式中，

52、“-”各自独立地为键；

53、h1、h2和h3各自独立地为无或血凝素茎部lah区域或其免疫原性片段，且h1、h2、和h3不同时为无。

54、在另一优选例中，h1、h2、和h3的氨基酸序列各自独立地选自下组：seq id no:7、8和9。

55、在另一优选例中，h1、h2、和h3序列互不相同。

56、在另一优选例中，h1具有seq id no:7所示氨基酸序列；h2具有seq id no:8所示氨基酸序列；h3具有seq id no:9所示氨基酸序列。

57、在另一优选例中，所述的连接肽选自下组：gg、ggs、(g3s)4、或其组合。

58、在另一优选例中，所述的重组蛋白具有seq id no:1所示的氨基酸序列。

59、在另一优选例中，所述的重组蛋白还具有任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

60、在另一优选例中，所述的标签序列包括6his标签。

61、在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。

62、在本发明的第二方面，提供了一种mrna疫苗，所述mrna疫苗编码如本发明第一方面所述的重组蛋白。

63、在另一优选例中，所述的mrna具有式(v)所示结构：

64、z1-z2-z3-z4-z5(v)

65、式中，

66、“-”各自独立地为键或接头；

67、z1为无或5'加帽元件；

68、z2为5'-utr元件；

69、z3为如权利要求1所述重组蛋白的编码序列；

70、z4为3'-utr元件；

71、z5为无或polya尾部元件。

72、在另一优选例中，所述的z1选自m7gpppg帽、3'-o-甲基-m7gpppg帽或抗反向帽类似物。

73、在另一优选例中，所述的mrna具有如seq id no:2所示的核苷酸序列。

74、在另一优选例中，所述的mrna序列是天然或修饰的mrna。

75、在另一优选例中，所述修饰的mrna包括通过用修饰的尿苷部分或全部取代天然尿苷对mrna进行修饰。

76、在另一优选例中，所述修饰的mrna为通过用1-甲基-假尿苷对天然尿苷进行全部替换。

77、在本发明的第三方面，提供了一种mrna疫苗组合物，所述的疫苗组合物包括：

78、(i)如本发明第二方面所述的mrna；

79、(ii)疫苗学上可接受的载体。

80、在另一优选例中，所述的载体为脂质纳米颗粒。

81、在另一优选例中，所述mrna或重组蛋白包封于所述脂质纳米颗粒中。

82、在另一优选例中，所述的脂质纳米颗粒选自下组：阳离子脂质、中性磷脂、甾族脂质、聚乙二醇-脂质、或其组合。

83、在另一优选例中，所述的疫苗组合物为注射剂型、或吸入剂。

84、在本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述的载体含有如本发明第二方面所述的多核苷酸。

85、在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒(如腺病毒、逆转录病毒)、或其他载体。

86、在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的表达载体。

87、在另一优选例中，所述的宿主细胞为哺乳动物细胞。

88、在本发明的第六方面，提供了一种制备如本发明第三方面所述的疫苗组合物的方法，包括步骤：

89、(s1)提供如本发明第二方面所述的mrna，和

90、(s2)将所述mrna与脂质纳米颗粒混合，从而形成包封有mrna的脂质体纳米颗粒。

91、在本发明的第七方面，提供了一种如本发明第一方面所述的重组蛋白、如本发明第二方面所述的多核苷酸、如本发明第三方面所述的疫苗组合物、如本发明第四方面所述的表达载体、和/或如本发明第五方面所述的宿主细胞的用途，用于制备一药物，所述药物用于：

92、(a)预防流感；和/或

93、(b)在哺乳动物中诱导产生针对流感病毒的体液免疫和/或细胞免疫。

94、在另一优选例中，所述的流感为甲型流感。

95、在另一优选例中，所述的流感包括人流感、禽流感、猪流感。

96、在另一优选例中，所述的流感由选自下组的病毒引起：h1n1、h3n2、h9n2。

97、在本发明的第八方面，提供了一种预防流感的方法，所述方法包括给有需要的对象施用如本发明第一方面所述的重组蛋白、如本发明第二方面所述的多核苷酸、如本发明第三方面所述的疫苗组合物、如本发明第四方面所述的表达载体、和/或如本发明第五方面所述的宿主细胞。

98、在另一优选例中，所述对象为人或非人类哺乳动物。

99、在另一优选例中，所述非人类哺乳动物包括：小鼠、大鼠、禽类、猪、狗、猫、家兔。

100、在本发明的另一方面，提供该通用流感mrna的用途，即在小鼠模型中诱导产生体液免疫应答的应用，在诱导产生细胞免疫应答的应用，在保护动物模型小鼠免受多种甲型流感病毒的侵害的应用。

101、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。