一种分离纯化糖基化修饰RNA的试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物，涉及一种分离纯化糖基化修饰rna的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、糖可以修饰脂质和蛋白质，调节生命所有领域的分子间和分子内的相互作用。在酶的作用下，蛋白质或脂类附加上糖类形成糖脂和糖蛋白的过程就是糖基化。近期的研究表明糖基化修饰也可以发生在rna，形成糖rna(glycorna)。

2、研究人员通过一系列生物化学方法，发现保守的非编码rna含有唾液酸化多糖，并且存在于多种细胞类型和哺乳动物物种体内。活细胞分析表明，大多数多糖修饰的rna存在于细胞表面。本研究通过对哺乳动物多糖修饰rna的鉴定，揭示了rna生物学和糖生物学之间存在直接的接口，并且rna在细胞外生物学中的作用也得到了扩展，为转录后修饰调控rna定位和功能提供了新的方向。但是目前尚未公开较为简便的分离纯化糖基化修饰rna的方法，以及与非酒精性脂肪肝相关的glycorna。

技术实现思路

1、本发明的目的就是针对现有技术的上述不足，提供一种分离纯化糖基化修饰rna的试剂盒。

2、本发明的另一目的是提供一种分离纯化糖基化修饰rna的方法。

3、本发明的又一目的是提供非酒精性脂肪肝辅助诊断试剂。

4、本发明的目的可通过以下技术方案实现：

5、一种分离纯化糖基化修饰rna的试剂盒，包含凝集素偶联的固相载体；所述的凝集素优选植物来源凝集素；进一步优选刀豆素a(concocnvalina，cona)、麦胚素(wheatgermagglutinin，wga)、花生凝集素(peanutagglutinin，pna)和大豆凝集素(soybeanagglutinin，sba)、siglec-11、siglec-14；所述的固相载体选自磁性固相载体，优选自葡聚糖磁珠、琼脂糖磁珠、树脂或环氧树脂、聚苯乙烯磁珠中的任意一种，或者两种及以上的磁性载体混合物。

6、所述的试剂盒在分离纯化糖基化修饰rna中的应用。

7、一种分离纯化糖基化修饰rna的方法，分离纯化样本中的总rna，向总rna中加入凝集素偶联的固相载体，孵育一段时间后分离凝集素偶联的固相载体捕获的rna，随后将凝集素偶联的固相载体捕获的rna从固相载体上洗脱下来，此即为糖基化修饰的rna。

8、作为本发明的一种优选，所述的凝集素为植物来源凝集素；优选刀豆素a、麦胚素、花生凝集素或大豆凝集素。

9、作为本发明的一种优选，所述的固相载体选自磁性固相载体选自葡聚糖磁珠、琼脂糖磁珠、树脂或环氧树脂、聚苯乙烯磁珠中的任意一种，或者两种及以上的磁性载体混合物。

10、作为本发明的一种优选，所述的固相载体粒径分布范围为1um-200um，优选为10um-200um，更进一步优选为30um-150um。

11、作为本发明的一种优选，孵育温度为20-30℃，孵育时间为50-70分钟。

12、作为本发明的进一步优选，孵育温度为25℃，孵育时间为60分钟。

13、作为本发明的一种优选，洗脱使用的洗脱剂为0.5mn-乙酰半乳糖胺(n-acetyl-d-glucosamine)。

14、一种非酒精性脂肪肝辅助诊断试剂，包含从血浆中分离糖基化修饰rna的试剂，以及检测糖基化rny5的试剂。rny5序列如下所示：

15、agttggtccgagtgttgtgggttattgttaagttgatttaacattgtctccccccacaaccgcgcttgac tagcttgctgtttt(seq id no.1)。

16、作为本发明的一种优选，所述的从血浆中分离糖基化修饰rna的试剂为凝集素偶联的固相载体；所述的检测糖基化rny5的试剂为定量检测糖基化rny5的试剂，包括但不限于northerblotting检测糖基化rny5的探针、定量pcr检测糖基化rny5的逆转录引物和特异性pcr引物对。

17、作为本发明的一种优选，所述的凝集素为刀豆素a、麦胚素、花生凝集素或大豆凝集素、siglec-11、siglec-14；所述的固相载体选自磁性固相载体选自葡聚糖磁珠、琼脂糖磁珠、树脂或环氧树脂、聚苯乙烯磁珠中的任意一种，或者两种及以上的磁性载体混合物。

18、作为本发明的一种优选，所述的固相载体所述固体载体粒径分布范围为1um-200um，优选为10um-200um，更进一步优选为30um-150um。

19、有益效果：

20、本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，开发了一类分离纯化糖基化修饰rna的方法和试剂盒。本发明人设计并构建了能够一类结构独特的糖基化修饰rna捕获载体，所述糖基化修饰rna捕获载体为表面经凝集素修饰的固相载体(如微球(bead)或磁珠等)。以糖基化修饰rna捕获磁珠为例，本发明的糖基化修饰rna捕获载体可以高效、特异性捕获样品中的糖基化修饰rna，配合高通量测序、northernblotting和rt-qpcr技术进行检测，可以快速、简便地、准确地检测样品中的糖基化修饰rna种类和数量。

21、本发明还提供了一种非酒精性脂肪肝辅助诊断试剂盒，使用该试剂盒进行非酒精性脂肪肝辅助诊断，用受试者工作特征曲线(receiveroperating characteristiccurve,简称roc曲线)分析糖基化修饰的rny5区分健康人(normal)和非酒精性脂肪肝(nafld)患者的曲线下面积为0.9955(95％ci:0.9834to1.000),准确率和精确率分别为100％和95.24％。

22、术语解释

23、凝集素

24、如本文所用，术语“凝集素”能够特异性识别糖基化修饰蛋白。凝集素是一类能够结合多糖基团的蛋白质，主要分布在细胞外基质中。细胞外基质中分布大量的糖蛋白和多糖基团，凝集素能够通过结合多糖基团来介导细胞之间的稳固连接。植物来源凝集素，如刀豆素a(concocnvalina，cona)、麦胚素(wheatgerm agglutinin，wga)、花生凝集素(peanutagglutinin，pna)和大豆凝集素(soybean agglutinin，sba)等，能够高效地结合多糖基团。

25、固相载体

26、固相载体是指表面经高分子材料包埋的复合磁珠，主要包括：葡聚糖磁珠、琼脂糖磁珠、树脂或环氧树脂、聚苯乙烯磁珠等复合磁珠中的任意一种，或者两种及以上的磁性载体混合物，所述固体载体粒径分布范围为1um-200um，优选为10um-200um，更进一步优选为30um-150um。在固相载体的生产中，同一批次生产固相载体的粒径也不是均一的，因此固相载体的粒径描述通常既可以采用平均粒径的方式，也可以采用本发明中粒径分布范围的方式。

27、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。