一种全发酵法高产L-甲硫氨酸的方法

(一)本发明涉及一种提高l-甲硫氨酸产量的全发酵方法。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、l-甲硫氨酸(l-methionine，l-met)的分子式为c5h11no2s，又名l-蛋氨酸，全称为2-氨基-4-甲巯基丁酸，是一种含硫的非极性α-氨基酸，与赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸等同属于天冬氨酸家族氨基酸，其化学索引号(cas)为63-68-3。根据甲硫氨酸的不同构型，可以分为d型和l型，其中仅有l型具有生物学活性。l-甲硫氨酸是生物体中唯一含有硫元素的必需氨基酸，在生物体中发挥重要的作用。l-甲硫氨酸最早于1922年由mueller从酪蛋白中分离出来，随后，barger和coyne确定了其结构式并正式命名为l-甲硫氨酸。之后人们开始对l-甲硫氨酸进行了大量的探索研究。现已知晓l-甲硫氨酸作为s-腺苷蛋氨酸(sam)的前体，充当甲基供体，参与一些重要代谢中间物合成，如硫辛酸、聚胺等。l-甲硫氨酸浓度的波动会改变sam的浓度，sam对于dna、rna等生物大分子的合成有着非常关键的作用。l-甲硫氨酸在细胞活动中也起着不可或缺的作用，包括调节许多蛋白质翻译后的修饰。因此，l-甲硫氨酸被广泛运用于饲料、食品、医药等行业。

2、目前，甲硫氨酸的生产方法主要是化学合成法，l-甲硫氨酸的化学合成方法有多种，按原料路线分主要有丙烯醛法、氨基内酯法、丙二酸酯法、酪朊水解法等。其中丙烯醛法，是最早但也是目前世界上l-甲硫氨酸生产公司最主要的生产工艺。该方法是由德国公司degussa ag在60年代早期发明，主要原理是以丙烯醛和甲硫醇为原料生成甲硫基丙醛，甲硫基丙醛再进行缩合水解生产l-甲硫氨酸。目前，罗纳-普朗克、迪高沙、孟山都等公司都有其特殊水解和酸化方法，由此在丙烯醛法的基础上，出现多种不同的技术专利，造就了l-甲硫氨酸生产工艺随着技术的发展不断进步。化学合成法反应步骤减少、生产成本降低、产物得率提高，但是在合成过程中仍不可避免的使用氢氰酸和甲硫醇等高挥发有毒底物，且存在反应条件苛刻、三废排放量大不易处理等问题，给环境造成了较为严重的污染。另外，酶法也是生产甲硫氨酸的一种重要方法，l-甲硫氨酸的酶解法主要为两种思路，一是消除外消旋混合物中的d-甲硫氨酸，二是将d-甲硫氨酸转化为l-甲硫氨酸，酶解法主要利用酶在体外反应来生产l-甲硫氨酸，但其原料价格普遍较高，生产过程控制繁琐，难适用于大规模的生产发酵。相比较这两种方法，微生物发酵法具有相对绿色的工艺模式和低廉的成本而被逐渐关注。但发酵法生产l-甲硫氨酸产量较低，仍是制约其工业化生产的最大障碍。

3、微生物发酵法相比于化学法和酶法，其反应条件温和，对环境影响较小，因此利用微生物发酵合成目标产物是一种较优的方法。自20世纪起不断有学者在探索利用生物法来生产l-甲硫氨酸，但由于l-甲硫氨酸的合成途径复杂，调控节点多，以及l-甲硫氨酸的生产会对菌体本身产生毒副作用等因素，目前还没有一株适合于大规模生产的l-甲硫氨酸高产菌株。现已公开的l-甲硫氨酸生产菌株主要有大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和百合棒杆菌(corynebacterium lilium)等。现有的对微生物发酵法的研究主要集中于菌种构建以及代谢研究，但大肠杆菌生产l-甲硫氨酸仍然存在重大障碍。例如，虽然已经提出了许多可行的工程细菌构建方案，但是葡萄糖生产l-甲硫氨酸的转化率仍然较低。

4、微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的需求。而如何提高葡萄糖生产l-甲硫氨酸的转化率成为亟待解决的问题，为此，考察甲硫氨酸生产菌株针对不同发酵调控过程中代谢通量的变化可以进一步了解其合成生物过程，为提高其发酵产量及糖酸转化率奠定基础。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种全发酵法高产l-甲硫氨酸的方法，该方法通过合理改变发酵培养基成分，运用不同发酵工艺及补料策略来提高l-甲硫氨酸产量、糖酸转化率并缩短发酵周期，解决了现有工艺存在的l-甲硫氨酸产量低，糖酸转化率低，发酵周期长等问题。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种全发酵法高产l-甲硫氨酸产量的方法，所述方法包括以下步骤：以产l-甲硫氨酸重组大肠杆菌为生产菌株，接种至含50mg/l卡那霉素抗性的发酵培养基中，培养温度为37℃，发酵时搅拌转速300-1000r/min；通过搅拌和通风控制溶氧值在20-30％，通过流加氨水控制ph在6.75-6.85；发酵至od600达到0.6-0.8时加入终浓度24mg/l的iptg，在30℃、300-1000r/min条件下进行诱导培养；发酵过程中，每4h取样检测od600、残糖含量和l-甲硫氨酸含量；在发酵至发酵液初始葡萄糖浓度低于2g/l后，采用溶氧反馈方式流加(优选当溶氧值高于30％时以40ml/h的流速流加)补料培养基维持溶氧值(do值)在20-30％；当od600达到10时以10-20ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；当od600达到30时以20-30ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；当od600达到45时以25-40ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；发酵后期，菌体逐渐死亡，溶氧值上升，当溶氧值上升至50％及以上停止流加；当溶氧值达到100％时发酵结束；

4、所述发酵培养基：葡萄糖10g/l、cacl2·2h2o 0.08g/l、mgso4·7h2o 5g/l、柠檬酸2.5g/l、kh2po4 2.5g/l、k2hpo4·3h2o 1.38g/l、fecl3·6h2o 0.12g/l、(nh4)2so43.3g/l、na2s2o3 3.95g/l、0.01g/l的vb12、0.01g/l的vb1、0.05g/l的l-赖氨酸、ssa 2ml/l、ssb 1ml/l；

5、补料培养基：葡萄糖500g/l、mgso4·7h2o 5g/l、fecl3·6h2o 0.06g/l、(nh4)2so433g/l、na2s2o3 39.5g/l、甜菜碱0.5g/l、ssa 1.6ml/l、ssb 0.8ml/l、0.01g/l的vb12、0.01g/l的vb1、0.05g/l的l-赖氨酸，溶剂为水；

6、所述ssa组成为：znso4·7h2o 8.5g/l、mncl2·2h2o 7.5g/l、cucl2·2h2o 0.75g/l、cocl2·6h2o 1.25g/l、edta 4g/l，溶剂为水。

7、所述ssb组成为：h3bo3 3g/l、na2moo4·2h2o 2.5g/l，溶剂为水。

8、优选的，所述生产菌株为大肠杆菌zjbssc362(escherichia coli zjbssc362)，保存于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期：2020年12月4日，保藏编号：cctcc no：m2020846，地址：中国武汉大学，邮编：430072，已在专利申请cn 112779200a中公开。

9、优选的，当od600达到10时以15ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；当od600达到30时以20ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；当od600达到45时以25ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；发酵后期，菌体逐渐死亡，溶氧值上升，当do值上升至50％及以上停止流加；当溶氧值达到100％时发酵结束。

10、优选的，所述生产菌株在接种前先进行斜面活化和种子扩大培养基，将种子液以体积浓度10-15％的接种量接种至发酵培养基；所述种子液按如下步骤制备：

11、(1)活化培养：将生产菌株接种到lb平板培养基上，37℃培养过夜，得到活化菌；所述lb平板培养基组成：蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 5g/l，琼脂粉20g/l，溶剂为水，ph＝6.8-7.0；

12、(2)一级种子培养：将步骤(1)得到的活化菌接种于lb液体培养基中，37℃、200rpm培养12h，得到一级种子液；lb液体培养基组成：蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 5g/l，溶剂为水，ph＝6.8-7.0；

13、(3)二级种子培养：将步骤(2)得到的一级种子液按体积浓度1-3％的接种量接种于lb液体培养基中，37℃、200rpm培养12-16h，得到二级种子液；所述lb液体培养基组成同步骤(2)。

14、与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

15、l-甲硫氨酸合成途径复杂，受较多因素的影响，通过代谢工程手段改造大肠杆菌积累往往会出现生长问题，本发明通过优化发酵培养基的初始糖浓度使菌体在前期能够尽快生长且不受到抑制，l-甲硫氨酸的积累得到提升；实验菌株为赖氨酸营养缺陷型菌株，需要在发酵液中添加赖氨酸，保证发酵过程中不会由于缺乏赖氨酸而对菌株发酵有负面影响。但同时基于前期对于l-甲硫氨酸发酵的研究，在l-甲硫氨酸发酵过程适当的“赖氨酸饥饿”会将代谢流流向l-甲硫氨酸的合成，因此需要一个合适的补料方法来控制发酵过程中赖氨酸的浓度。同时为解决菌体早衰和产酸效率低，提高中后期菌体活力，基于发酵的不同阶段菌体生长和产物合成对环境的不同要求，对各种葡萄糖流加策略进行了摸索，提高后期细胞产酸能力，进一步提高l-甲硫氨酸产量。最终得到的先采用溶氧反馈流加补料培养基使菌体生长到一定的密度，再采用分阶段变速补料的策略成功解决了发酵过程底物抑制、产物反馈抑制、代谢工程菌发酵过程中乙酸浓度过高等问题，l-甲硫氨酸产量从18.2g/l提升至31.71g/l，最高糖酸转化率提高至12.2％，同时发酵时间缩短至68h，因此，具有重要的工业应用价值，同时对其它氨基酸及其相关化合物的发酵生产具有一定的指导意义。