一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其构建方法和应用与流程

本发明涉及肿瘤生物免疫治疗，尤其是涉及一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其构建方法和应用。

背景技术：

1、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t cell，car-t)疗法是通过基因工程技术在t细胞表面人工表达能识别特定肿瘤表面抗原的抗原结合域，使t细胞获得抗体的特异性肿瘤识别能力，并识别肿瘤细胞之后通过car的胞内信号区激活t细胞，从使car-t细胞通过释放细胞因子、颗粒酶等方式发挥细胞毒作用，从而靶向清除恶性肿瘤细胞的一种新型免疫疗法。多项临床研究已经证实，这种工程化t细胞能够对多种难治性血液肿瘤显示出高效的抗肿瘤活性。然而，car-t细胞也会因脱靶效应等，导致一些临床副作用和毒性。

2、目前，car-t在b细胞恶性血液肿瘤和多发性骨髓瘤中已经展现出了很好的疗效，已有六款以cd19和bcma为靶抗原的car-t细胞产品经美国fda批准上市。然而在髓系恶性血液肿瘤和实体瘤中，car-t细胞仍然作用有限，其临床应用也鲜有进展。有研究已研制出多种靶向aml不同靶点的car-t细胞，主要的靶点有cll-1，cd33，cd123等。虽然上述几种靶向aml肿瘤表面抗原的cart已投入临床试验，但是效果均较不佳。根据现有研究表明，靶向cll-1的car-t细胞在临床试验中的疗效佳，但由于cll-1在正常粒细胞中也表达，因此会引起严重的粒细胞缺乏症从而影响治疗后患者的正常造血功能恢复，使用cll1 cart治疗的患者往往需要桥接造血干细胞移植，这很大程度上限制了此cart的临床应用；而靶向cd123的car-t细胞治疗的临床数据显示cr率很低，效果不佳，而此外的靶向其他靶点的car-t细胞也均未达到理想的疗效。限制car-t细胞对aml疗效的很重要的一个原因在于缺乏稳定表达于髓系恶性肿瘤细胞表面而不存在于正常细胞之上的特异性靶抗原，靶点的特异性越强，越有助于car-t细胞识别和杀伤肿瘤细胞，也有利于减轻car-t细胞的脱靶毒性。

3、因此，亟需新的针对aml的cart治疗靶点并设计和构建cart细胞。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其构建方法和应用。本发明构建出嵌合抗原受体，结合目前car-t工程技术，制备出能够特异性识别和杀伤髓系肿瘤等恶性肿瘤的免疫应答细胞(例如t细胞)，有希望为今后靶向siglec6的其他免疫效应细胞疗法的设计提供依据，有希望为急性髓系白血病的治疗提供一种新的方法。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一目的，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含：

4、从羧基端到氨基端依次为标签蛋白、切割蛋白、信号肽结构域、抗原结合结构域，跨膜结构域，共刺激信号结构域，胞内信号传导结构域；所述抗原为siglec6。

5、本发明的嵌合抗原受体上融合标签蛋白，用于标记、分选、消除宿主细胞。跨膜结构域用于锚定结合细胞膜，在抗原识别之后，激活信号被跨膜结构域传递到细胞内部。

6、本发明构建的嵌合抗原受体靶向的siglec6抗原在原代aml母细胞及aml干细胞亚群中表达，而在正常的中性粒细胞及造血干细胞等细胞亚群中不表达，因此能在赋予免疫应答细胞(例如t细胞)特异性识别aml肿瘤细胞及更强抗肿瘤能力的同时也不会造成粒细胞缺乏等脱靶毒性。

7、作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述标签蛋白包括rqr8、egfrt、cd20、c-myc、6×his、gst、fc、flag、ha中的至少一种；所述切割蛋白包括切割蛋白2a或弗林蛋白酶；所述切割蛋白2a包括切割蛋白t2a、切割蛋白p2a、切割蛋白e2a、切割蛋白f2a中的至少一种。

8、所述标签蛋白可以通过可切割蛋白(可以为2a或弗林蛋白酶)或启动子与car连接存在于car构建体上。

9、作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述标签蛋白为rqr8，所述切割蛋白为切割蛋白t2a；所述rqr8的氨基酸序列如seq id no：1所示；所述切割蛋白t2a的氨基酸序列如seq id no：2所示。

10、该嵌合抗原受体的结构带有rqr8自杀开关，当car-t细胞在治疗过程中毒性过强时，可利用cd20单抗启动抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(adcc)作用和补体依赖的细胞毒性(cdc)作用以诱导cart自杀，从而使其更加安全可控，具有较高临床应用价值。

11、作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述信号肽结构域包括人cd8α信号肽结构域、人gm-csf信号肽结构域、人胰岛素信号肽结构域、人il-2信号肽结构域、人胰蛋白酶原信号肽结构域中的至少一种，优选地，所述信号肽结构域为人cd8α信号肽结构域，所述人cd8α信号肽的氨基酸序列如seq id no：3所示。

12、作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述抗原结合结构域为抗siglec6的单链抗体核酸序列。

13、作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述抗siglec6的单链抗体核酸序列由重链可变区和轻链可变区组成，所述重链可变区和轻链可变区通过至少一个linker连接。其排列方式可为vh—linker—vl或vl—linker—vh。

14、在一些实施例中，重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)来源于全人源抗体jml1。

15、在一些实施例中，linker的长度可以为1～25个或多个氨基酸。

16、作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述linker包括甘氨酸聚合物(g)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(g1-5s1-5)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、lrqkd(gggs)2erp、dgggs、lrqrdgerp、tgekp、kesgsvsseqlaqfrsld、egkssgsgseskvd、ggrrgggs、ggrr、lrqkdgggserp和(ggggs)n中的至少一种；甘氨酸聚合物(g)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(g1-5s1-5)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物为柔性linker；

17、其中，甘氨酸-丝氨酸聚合物(g1-5s1-5)n中的n为大于1的整数；

18、(ggggs)n中的n为1、2、3、4或5。

19、本发明选用的linker不限于上述种类，还包括其他柔性linker或刚性linker。刚性linker包括但不限于(xp)n和(eaaak)n，其中x可为指定任何氨基酸，1≤n≤10。

20、优选地，所述嵌合抗原受体还包括铰链结构域，跨膜结构域与所述抗原结合结构域之间可直接连接或由铰链结构域连接。

21、铰链结构域是将抗原结合结构域连接至跨膜结构域的一段足够柔性的氨基酸结构，允许抗原结合结构域定向在不同的方向上，以利于抗原识别。铰链结构域包括人cd8α铰链区、人cd28铰链区、人免疫球蛋白恒定区或其变体、人免疫球蛋白铰链区、人igg4铰链区、人免疫球蛋白ch1/cl区、fc区、人免疫球蛋白ch2结构域、人免疫球蛋白ch3结构域中的至少一种。优选地，所述铰链结构域为人cd8α铰链区。所述人cd8α铰链区的氨基酸序列如seq idno：5所示。

22、作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述抗siglec6的单链抗体核酸序列如seq id no：4所示。

23、作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述跨膜结构域包括人cd8跨膜区、人cd8α跨膜区、人cd28跨膜区、人cd4跨膜区、人cd28跨膜区、人cd3ζ跨膜区、人cd137/4-1bb跨膜区、人cd134/ox40跨膜区、人icos跨膜区、人cd5跨膜区、人cd9跨膜区、人cd16跨膜区、人cd22跨膜区、人cd33跨膜区、人cd37跨膜区、人cd45跨膜区、人cd64跨膜区、人cd80跨膜区、人cd86跨膜区、人cd154跨膜区、人tcrα跨膜区、人tcrβ跨膜区中的至少一种；优选地，所述跨膜结构域为人cd8跨膜区，所述人cd8跨膜区的氨基酸序列如seq id no：6所示。

24、作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述共刺激信号结构域包括人cd28胞内共刺激信号结构域、人cd137/4-1bb胞内共刺激信号结构域、人cd134/ox40胞内共刺激信号结构域、人cd27胞内共刺激信号结构域、人icos胞内共刺激信号结构域、人b7-h3胞内共刺激信号结构域、人2b4胞内共刺激信号结构域、人dap10胞内共刺激信号结构域、人dnam1胞内共刺激信号结构域、人dap12胞内共刺激信号结构域中的至少一种；所述胞内信号传导结构域包括人cd3ζ或人fcεriγ；优选地，所述共刺激信号结构域为人cd137/4-1bb胞内共刺激信号结构域，所述人cd137/4-1bb胞内共刺激信号结构域的氨基酸序列如seqid no：7所示；所述胞内信号传导结构域为cd3ζ胞内信号传导结构域，所述cd3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如seq id no：8所示。

25、第二目的，本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的核酸，编码所述嵌合抗原受体的核酸的核苷酸序列从5’端到3’端依次为编码标签蛋白的核苷酸序列、编码切割蛋白的核苷酸序列、编码信号肽结构域的核苷酸序列、编码抗原结合结构域的核苷酸序列，编码铰链结构域的核苷酸序列、编码跨膜结构域的核苷酸序列，编码共刺激信号结构域的核苷酸序列，编码胞内信号传导结构域的核苷酸序列。

26、优选地，编码所述嵌合抗原受体的核酸的核苷酸序列从5’端到3’端依次为编码标签蛋白rqr8的核苷酸序列、编码切割蛋白t2a的核苷酸序列、编码所述人cd8α信号肽的核苷酸序列、编码抗siglec6的单链抗体核酸序列(抗人siglec6 scfv的核苷酸序列)、编码人cd8α铰链区的核苷酸序列、编码人cd8α跨膜区的核苷酸序列、编码人cd137/4-1bb共刺激信号结构域的核苷酸序列、编码人cd3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列。

27、在一实施方式中，所述编码人rqr8的核苷酸序列如seq id no：9所示。

28、在一实施方式中，所述编码切割蛋白t2a的核苷酸序列如seq id no：10所示。

29、在一实施方式中，所述编码人cd8α信号肽的核苷酸序列seq id no：11所示。

30、在一实施方式中，所述编码抗siglec6的单链抗体核酸序列如seq id no：12所示。

31、在一实施方式中，所述编码人cd8α铰链区的核苷酸序列如seq id no：13所示。

32、在一实施方式中，所述编码人cd8α跨膜区的核苷酸序列如seq id no：14所示。

33、在一实施方式中，所述编码人cd137/4-1bb共刺激信号结构域的核苷酸序列如seqid no：15所示。

34、在一实施方式中，所述编码人cd3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列如seq idno：16所示。

35、第三目的，本发明提供了一种包含上述核酸的重组表达载体。本发明的重组表达载体包括但不限于重组dna或rna构建体、慢病毒载体、γ-逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺联病毒载体等病毒载体、一些非病毒载体、电转导载体、睡美人转座子载体。

36、在一实施方式中，所述重组表达载体为重组dna构建体。

37、本发明将上述的重组表达载体转染至免疫应答细胞(例如t细胞、nk细胞)，可实现对该免疫应答细胞的靶向car修饰。

38、本发明构建重组表达载体中还含有启动子，所述启动子包括但不限于ef1α启动子，mnd启动子，mscv启动子，cmv启动子。在一实施方式中，所述启动子为ef1α启动子。

39、第四目的，本发明提供了一种包含上述核酸的重组病毒。本发明所述的重组病毒包括但不限于慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺联病毒。

40、在一些实施方式中，所述重组病毒为上述的重组表达载体与辅助包装质粒pspax2和pmd2g共转染293t细胞得到的重组病毒。

41、第五目的，本发明提供了一种所述的嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞。在一些实施方式中，所述免疫应答细胞为t淋巴细胞、nk细胞或nkt细胞。

42、在一实施方式中，所述免疫应答细胞为t淋巴细胞。

43、本发明构建的靶向人siglec6靶点的免疫应答细胞(例如靶向siglec6的car-t细胞)在直接抗肿瘤的同时能够减轻脱靶效应和car-t细胞过度扩增带来的例如粒细胞缺乏等的毒副作用，改善恶性肿瘤的预后

44、siglec6(cd327)全称结合免疫球蛋白样凝集素(siglec)-6，表达于包括aml干细胞亚群在内的原代aml肿瘤细胞，而在正常的造血干细胞和祖细胞、t细胞、nk细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞上几乎不表达；在其他恶性细胞和组织中，siglec6也有着不同程度的表达，如慢性淋巴细胞白血病、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、克隆性肥大细胞疾病和甲状腺癌等，这提示siglec6是一个有前景的抗肿瘤治疗靶点。本发明构建得到的免疫应答细胞可以在尽量减少副作用和毒性的基础上用于恶性肿瘤的治疗。

45、第六目的，本发明提供了所述的免疫应答细胞在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。

46、优选地，免疫应答细胞可以是淋巴谱系的细胞。所述淋巴谱系的细胞选自t、b和nk细胞。所述t细胞包括但不限于细胞毒性t细胞、辅助性t细胞、记忆t细胞(包括干细胞样t细胞、中央记忆t细胞)、效应t细胞、调节性t细胞、自然杀伤t细胞和γδt细胞。在一些优选实施方式中，本发明的免疫应答细胞是t细胞。

47、本发明构建的免疫应答细胞不仅用于治疗急性髓系白血病，还可以用于治疗慢性淋巴细胞白血病、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、克隆性肥大细胞疾病等血液系统恶性肿瘤及实体恶性肿瘤(甲状腺癌等)。

48、第七目的，本发明提供了所述的免疫应答细胞的构建方法，所述方法包括将上述编码上述嵌合抗原受体的核酸引入细胞的步骤。

49、所述的免疫应答细胞的构建方法具体构建方法，包括以下步骤：

50、s1、将编码所述的嵌合抗原受体的核酸以及rqr8标签蛋白的核苷酸序列通过分子克隆方式重组连接到慢病毒载体上，经测序鉴定，构建出包含抗siglec6的单链抗体核酸序列的全长car序列以及编码独立于car表达的rqr8标签蛋白的核苷酸序列的慢病毒表达载体；

51、s2、将步骤s1构建的慢病毒表达载体转化感受态细胞，通过摇菌、质粒提取，得到扩增的anti-siglec6-car表达质粒；将anti-siglec6-car表达质粒和病毒包装辅助质粒pspax2和pmd2g共转染293t细胞得到重组慢病毒；

52、s3、分离患者外周血单个核细胞，从中阳性分选/阴性分选出cd3+t细胞，经磁珠刺激扩大培养后即可获得免疫应答细胞。

53、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

54、本发明基于抗siglec6的单链抗体核酸序列构建了靶向人siglec6的嵌合抗原受体(car)以及该car的重组表达载体和该car修饰的免疫应答细胞(例如t细胞，anti-siglec6 car-t)。该car结构通过抗原特异性识别siglec6后，可以激活该免疫应答细胞，启动其细胞毒性杀伤作用，靶向杀伤aml肿瘤细胞及白血病干细胞。该免疫应答细胞不会杀伤正常的造血干细胞和祖细胞、t细胞、nk细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞，理论上不会产生诸如粒细胞缺乏症等毒副作用。经体内外实验证明，该car-t细胞能精准有效的靶向攻击aml肿瘤细胞，可用来制备用于肿瘤生物免疫治疗的生物制剂。该car-t细胞中还加入了用于终止car-t细胞过度扩增的rqr8开关，保证了其安全性。本发明提供的anti-siglec6car-t为恶性肿瘤治疗提供了一种新的方案，具有较大的基础研究及临床应用价值，具有良好的产业前景。