一种同时检测多种药物多种细菌最低抑菌浓度的方法及其应用与流程

本发明属于微生物领域，具体涉及一种同时检测多种药物多种细菌最低抑菌浓度的方法及其应用。

背景技术：

1、最低抑菌浓度(minimum inhibit concentration)为最低抑制病原微生物繁殖的药物浓度，用于衡量抗感染药(包括抗生素、抗菌药、化学合成药)抵抗病原微生物的能力。

2、cn115418388a公开了一种改进二倍稀释法测定真菌最低抑菌浓度(mic)的测定方法。所述改进方法为使用倒置显微镜在微观水平上观察孢子的萌发状态，从而判定真菌的最低抑菌浓度。所述方法可以避免肉眼观察是否生成沉淀的主观判断，还可以防止某些真菌因生长缓慢在24h后未形成可见沉淀，无法判断最低抑菌浓度的缺陷；所述方法可以解决以od值判断真菌生长情况和确定最低抑菌浓度不准确的难题，更好的避免抑菌剂本身颜色所带来的od值影响，拓宽二倍稀释法的应用背景，更好的适应真菌mic的测定。

3、cn110628592a公开了一种快速检测淋球菌最低抑菌浓度的装置，包括测试平台，测试平台包括基底层、测试层和加料层，测试层复合在基底层和加料层之间，加料层上开设加料孔，测试层上对应每个加料孔的位置设有测试区，测试区通过第一隔断结构与测试层上的空白位置隔离开来，每个测试区和相邻的其他测试区之间设有第二隔断结构，第一隔断结构和第二隔断结构内设有隔断物。本发明还公开了该装置的制备方法，该发明还公开了一种快速检测淋球菌最低抑菌浓度的检测方法。该发明检测装置结构设计简洁，携带方便；检测装置制备方法简单，成本低；该发明的检测方法能够简便的测试出抗生素最低抑菌浓度，结果准确。

4、检测药物最低抑菌浓度，目前采用的主要的方法有常量肉汤稀释法、琼脂稀释法、微量肉汤稀释法等。但是当同时检测多种药物、多种细菌的最低抑菌浓度时，常常出现质控失控的情况或质控组过多的问题，因此，从减少质控实验的角度出发，优化最低抑菌浓度检测试验是非常有意义的。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种同时检测多种药物多种细菌最低抑菌浓度的方法及其应用。

2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种同时检测多种药物多种细菌最低抑菌浓度的方法，所述同时检测多种药物多种细菌最低抑菌浓度的方法包括：

4、(1)设置实验组、阳性对照组、一个阴性对照组和一个质控组；向各组检测容器中加入培养基；其中实验组和质控组继续加入待测药物，并依次梯度稀释；

5、(2)实验组和阳性对照组的检测容器中接种待测菌株；质控组的检测容器中接种质控菌株；

6、(3)各组检测容器在33-37℃下静置16-24h，根据菌株生长情况确定最低抑菌浓度。

7、本发明创造性地提出在同时检测多种药物多种细菌最低抑菌浓度时，仅需设置一个质控组即可，无需根据细菌种类设置多组质控，可以有效避免质控实验过多，存在的个别实验组中质控菌株的最低抑菌浓度不在质控菌株质控范围内的问题。此外，减少检测操作步骤也有利于提高整体检测效率，尤其是检测多种微生物的最低抑菌浓度时，减少质控组将显著提升检测效率。

8、所述33-37℃中的具体数值可以选择33℃、34℃、35℃、36℃或37℃等；

9、所述16-24h中的具体数值可以选择16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h等；

10、上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

11、优选地，步骤(1)所述梯度稀释的稀释倍数为2倍；

12、优选地，步骤(1)所述梯度稀释的次数为5-20次。

13、所述5-20次中的具体数值可以选择5次、7次、9次、11次、13次、15次、17次、19次或20次等；

14、上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

15、优选地，步骤(1)所述检测容器为96孔板；

16、优选地，所述实验组96孔板1板上的药物数量为1种。

17、本发明所涉及的检测容器为96孔板，且实验组每个96孔板上的药物数量仅为1组，在同一个96孔板上设置两种以上的药物会造成药物之间的干扰，进而影响最终检测结果的准确性。

18、优选地，步骤(1)所述加入待测药液后混匀至少5次以上。

19、所述5次以上的具体数值可以选择5次、6次、7次或8次等；

20、上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

21、本发明所涉及地待测药液后混匀至少5次以上，才能保证药物与培养基成分混合均匀，从而避免由于初始溶液不均匀造成的后续以此为基础的稀释溶液严重的浓度差异。因此待测药液后混匀至少5次以上可以有效提升最低抑菌浓度的检测准确性。

22、优选地，步骤(1)所述药物包括亚胺培南、左氧氟沙星、头孢曲松钠、万古霉素、克拉霉素、阿莫西林或罗红霉素中的任意一种。

23、本发明所述的待测药物可以选择本领域技术人员熟知的任意一种药物，例如常见的抗生素药物：亚胺培南、左氧氟沙星、头孢曲松钠、万古霉素、克拉霉素、阿莫西林、罗红霉素。

24、优选地，步骤(2)所述待测菌株包括铜绿假单胞杆菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、乳酸菌或芽孢杆菌中的任意一种。

25、本发明所述的待测菌株可以选择本领域技术人员熟知的任意一种细菌，例如铜绿假单胞杆菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、乳酸菌、芽孢杆菌。

26、优选地，步骤(2)所述质控的菌株类型包括革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。

27、优选地，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌。

28、优选地，所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌。

29、本发明所述质控的菌株类型包括革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，其中常用的革兰氏阴性菌为大肠杆菌，例如atcc 25922菌株等，革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌，例如atcc29213菌株等。

30、优选地，步骤(2)所述待测菌株接种后菌液中活菌数为5×104cfu；

31、优选地，步骤(2)所述质控菌株接种后菌液中活菌数为5×104cfu。

32、本发明所述待测菌株及质控菌株常用的接种后的菌液中活菌数为5×104cfu。

33、优选地，步骤(2)所述接种操作的总时间不超过30min。

34、所述不超过30min的具体数值可以选择30min、29min、28min、27min、26min或25min等；

35、上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

36、本发明所涉及地菌株接种总时间不应超过30min，由于在同时检测多种药物多种细菌最低抑菌浓度时，往往需要设置多组实验，过多的实验组会造成菌种接种时间较长。当菌株接种总时间超过30min时，接种的第一个与最后一个的微生物生长时间差异巨大，但检测生长情况时为同一时间，从而造成检测准确性下降。

37、第二方面，本发明提供如第一方面所述的同时检测多种药物多种细菌最低抑菌浓度的方法在抗生素耐药性检测中的应用。

38、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

39、本发明创造性地提出在同时检测多种药物多种细菌最低抑菌浓度时，仅需设置一个质控组即可，无需根据细菌种类设置多组质控，可以有效避免质控实验过多，存在的个别实验组中质控菌株的最低抑菌浓度不在质控菌株质控范围内的问题。此外，减少检测操作步骤也有利于提高整体检测效率，尤其是检测多种微生物的最低抑菌浓度时，减少质控组将显著提升检测效率。