高效利用丙酸盐的裂殖壶菌、应用和处理丙酸盐废水并积累高价值DHA的方法

本发明属于生物化工，尤其是一株高效利用丙酸盐的裂殖壶菌、应用和处理丙酸盐废水并积累高价值dha的方法。

背景技术：

1、丙酸（propanoic acid），又称初油酸，是一种短链饱和脂肪酸，化学式ch3ch2cooh，其分解途径与脂肪酸的β-氧化路径一样，通常需要与辅酶a结合形成丙酰-coa才能被生物体利用。由于丙酰-coa的主体含有3个碳原子，不能直接参与β-氧化过程，也不能直接进入三羧酸循环。丙酸能改变膜的通透性，从而使微生物失活，对霉菌、细菌有很好的抑制作用，因此在食品加工过程中常采用丙酸作为防腐剂，然而大量使用会导致过量丙酸/丙酸盐废水外排。此外，为了节约能源和控制温室气体排放，将煤气化为天然气成为了当下的流行趋势，包括中国和欧盟，都开展了广泛的煤炭产业布局。然而，1吨煤气化会产生3吨废水，虽然废水中的co2，h2s和酚类物质都有了解决方案，但是废水中的丙酸却缺乏解决方案。

2、煤气化废水的直接排放，不仅会严重污染环境，还会造成水资源的极大浪费。丙酸属于弱电解质（ka＝1.34×10-5），其水溶液呈弱酸性，腐蚀性强，其蒸汽对皮肤和呼吸道有刺激性，丙酸废水对环境有危害，对水体可造成污染；吸入丙酸蒸汽对呼吸道有强烈刺激性，可引发人体肺水肿，且对人眼有强烈的刺激性。

3、丙酸/丙酸盐的大量生产与使用，会加剧其向土壤、水体等环境的排放。目前，国内处理丙酸废水的方法主要有：铁碳微电解，混凝沉淀，uasb，二沉池处理工艺及fenton法，絮凝沉淀预处理和生化工艺等。虽然关于丙酸废水处理的技术逐步完善，但是丙酸废水中的丙酸盐难以回收利用。微生物及动物体内存在完善的偶数碳代谢途径，但是丙酸盐摄入体内会产生丙酰辅酶a，大多数微生物及动物无法代谢，会对其生长和发育产生严重的影响。

4、裂殖壶菌是一种dha（二十二碳六烯酸）含量高的异养海洋原生生物，因其生长速度快、dha含量丰富、安全认证、易于培养等特点，被广泛应用于科研和商业生产。裂殖壶菌具有独特的代谢途径代谢利用丙酰辅酶a，并且其本身对丙酸盐具有耐受性，在一定的丙酸盐浓度下，裂殖壶菌仍能保持较高的生物量。因此，选用裂殖壶菌进行丙酸盐的利用研究，不仅有助于改善环境，还可以产出各种高价值产物。然而，裂殖壶菌对丙酸盐的利用能力还有待提高。

5、通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一株高效利用丙酸盐的裂殖壶菌、应用和处理丙酸盐废水并积累高价值dha的方法。

2、本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

3、一株高效利用丙酸盐的裂殖壶菌，所述裂殖壶菌是通过丙酸盐废水为基础，利用丙酸钠梯度配制2g/l、4g/l、6g/l、8g/l的丙酸盐废水，使用该丙酸盐废水作为溶剂配制完全取代培养基对裂殖壶菌进行适应性驯化获得的。

4、进一步地，驯化的方法包括如下步骤：

5、取冻存在20%甘油管中的裂殖壶菌菌株1ml，加入正常的裂殖壶菌种子液的种子培养基即清水作为溶剂的种子培养基中，连续培养3代，每代培养24h，然后按1%的接种量比例加入到2g/l丙酸盐废水作为溶剂的种子培养基中驯化，驯化30代，然后继续按1%的接种量比例加入到4g/l丙酸盐废水作为溶剂的种子培养基中驯化，驯化30代，然后继续按1%的接种量比例加入到6g/l丙酸盐废水作为溶剂的种子培养基中驯化，驯化30代，然后继续按1%的接种量比例加入到8g/l丙酸盐废水作为溶剂的种子培养基中驯化，驯化30代；同时，分别取2g/l、4g/l、6g/l、8g/l的丙酸盐废水驯化结束后的种子液分别进行生物量测定；

6、驯化成功后，最终得到丙酸耐受能力达到6g/l的高效利用丙酸盐的裂殖壶菌。

7、进一步地，所述裂殖壶菌在丙酸盐浓度超过6g/l后，裂殖壶菌不能生长；

8、或者，所述丙酸盐废水来自面包房生产废水，该面包使用丙酸钠做防腐剂，所述废水中含有丙酸钠，浓度为2.4g/l；

9、或者，所述冻存在20%甘油管中的裂殖壶菌菌株为裂殖壶菌（schizochytriumsp.）hx-308（该菌株为现有技术中的公知菌侏，例如在专利公开号cn104974944a中已经公开，该菌侏已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，其保藏编号为cctccno.m209059）。

10、进一步地，所述正常的裂殖壶菌种子液的种子培养基为：培养基的ph为6.4，且包括：葡萄糖50g/l，酵母浸粉5g/l，硫酸钠5g/l，硫酸镁2g/l，硫酸铵6g/l，氯化钾1g/l，氯化钙0.1g/l，硫酸钾0.6g/l，磷酸二氢钾1g/l，谷氨酸钠10g/l，七水合硫酸锌3mg/l，六水合氯化钴0.05mg/l，五水合硫酸铜5mg/l，六水合硫酸镍1mg/l，七水合硫酸铁10mg/l，泛酸钙4mg/l，四水合氯化锰5mg/l，二水合钼酸钠0.04mg/l；溶剂使用清水配制；

11、2g/l丙酸盐废水作为溶剂的培养基为：培养基的ph为6.4，且包括：葡萄糖50g/l，酵母浸粉5g/l，硫酸钠5g/l，硫酸镁2g/l，硫酸铵6g/l，氯化钾1g/l，氯化钙0.1g/l，硫酸钾0.6g/l，磷酸二氢钾1g/l，谷氨酸钠10g/l，七水合硫酸锌3mg/l，六水合氯化钴0.05mg/l，五水合硫酸铜5mg/l，六水合硫酸镍1mg/l，七水合硫酸铁10mg/l，泛酸钙4mg/l，四水合氯化锰5mg/l，二水合钼酸钠0.04mg/l；溶剂使用2g/l丙酸盐废水完全取代清水配制；

12、4g/l丙酸盐废水作为溶剂的培养基为：培养基的ph为6.4，且包括：葡萄糖50g/l，酵母浸粉5g/l，硫酸钠5g/l，硫酸镁2g/l，硫酸铵6g/l，氯化钾1g/l，氯化钙0.1g/l，硫酸钾0.6g/l，磷酸二氢钾1g/l，谷氨酸钠10g/l，七水合硫酸锌3mg/l，六水合氯化钴0.05mg/l，五水合硫酸铜5mg/l，六水合硫酸镍1mg/l，七水合硫酸铁10mg/l，泛酸钙4mg/l，四水合氯化锰5mg/l，二水合钼酸钠0.04mg/l；溶剂使用4g/l丙酸盐废水完全取代清水配制；

13、6g/l丙酸盐废水作为溶剂的培养基为：培养基的ph为6.4，且包括：葡萄糖50g/l，酵母浸粉5g/l，硫酸钠5g/l，硫酸镁2g/l，硫酸铵6g/l，氯化钾1g/l，氯化钙0.1g/l，硫酸钾0.6g/l，磷酸二氢钾1g/l，谷氨酸钠10g/l，七水合硫酸锌3mg/l，六水合氯化钴0.05mg/l，五水合硫酸铜5mg/l，六水合硫酸镍1mg/l，七水合硫酸铁10mg/l，泛酸钙4mg/l，四水合氯化锰5mg/l，二水合钼酸钠0.04mg/l；溶剂使用6g/l丙酸盐废水完全取代清水配制；

14、8g/l丙酸盐废水作为溶剂的培养基为：培养基的ph为6.4，且包括：葡萄糖50g/l，酵母浸粉5g/l，硫酸钠5g/l，硫酸镁2g/l，硫酸铵6g/l，氯化钾1g/l，氯化钙0.1g/l，硫酸钾0.6g/l，磷酸二氢钾1g/l，谷氨酸钠10g/l，七水合硫酸锌3mg/l，六水合氯化钴0.05mg/l，五水合硫酸铜5mg/l，六水合硫酸镍1mg/l，七水合硫酸铁10mg/l，泛酸钙4mg/l，四水合氯化锰5mg/l，二水合钼酸钠0.04mg/l；溶剂使用8g/l丙酸盐废水完全取代清水配制。

15、如上所述的高效利用丙酸盐的裂殖壶菌在丙酸盐废水处理并同时制备dha方面中的应用。

16、利用如上所述的高效利用丙酸盐的裂殖壶菌处理丙酸盐废水并积累高价值dha的方法，包括如下步骤：

17、将高效利用丙酸盐的裂殖壶菌菌株接种于种子培养基活化后，获得发酵用菌种；将发酵用菌种接种于发酵培养基中进行发酵培养；收集菌体提取油脂，得到dha。

18、进一步地，所述发酵培养的整个周期能够达到60h，例如可以为12h、24h、36h、48h或60h；

19、或者，所述培养的条件为25～30℃，150～250r/min振摇培养；

20、或者，所述收集菌体提取油脂的方法包括：

21、1）向发酵培养结束后的发酵液中加入naoh溶液调ph=11-13后，加入质量终浓度0.01-0.4%的破壁酶，40~60℃，100～200r/min振荡5~15h；

22、2）冷却至室温，加入等体积无水乙醇失活破壁酶；

23、3）加入正己烷萃取，收集上层有机相；

24、4）重复步骤3）若干次，合并有机相，挥干溶剂，得到脂质

25、进一步地，所述种子培养基、发酵培养基完全使用丙酸盐废水作为溶剂进行配制；

26、或者，所述发酵用菌种通过以下方法得到：

27、将高效利用丙酸盐的裂殖壶菌菌株接种于平板培养基培养后，挑取单菌落接种于种子培养基活化，培养获得一级种子；取一级种子接种于种子培养基中，培养获得二级种子；取二级种子接种于种子培养基中，培养获得三级种子，作为发酵用菌种。

28、进一步地，所述平板培养基为：培养基的ph值为6.0～6.5，且包括：琼脂15-20g/l，葡萄糖30-60g/l，酵母浸粉8～15g/l，硫酸钠10~15g/l，硫酸镁2~4g/l，硫酸铵6~12g/l，氯化钾1~2g/l，氯化钙0.1~0.2g/l，硫酸钾0.5~1g/l，磷酸二氢钾0.5~2g/l，谷氨酸钠8～12g/l，七水合硫酸锌1~5mg/l，六水合氯化钴0.01~0.1mg/l，五水合硫酸铜2~6mg/l，六水合硫酸镍1~2mg/l，七水合硫酸铁8~15mg/l，泛酸钙2~4mg/l，四水合氯化锰3~5mg/l，二水合钼酸钠0.04mg/l，维生素b63-10mg/l、维生素b120.3-1.2mg/l；溶剂使用6g/l丙酸盐废水完全取代清水配制；

29、所述种子培养基为：培养基的ph值为6.0～6.5，且包括：葡萄糖40-60g/l，酵母浸粉4～6g/l，硫酸钠5~8g/l，硫酸镁2~4g/l，硫酸铵4~8g/l，氯化钾1~2g/l，氯化钙0.1~0.2g/l，硫酸钾0.5~1g/l，磷酸二氢钾0.5~2g/l，谷氨酸钠8～12g/l，七水合硫酸锌1~5mg/l，六水合氯化钴0.01~0.1mg/l，五水合硫酸铜2~6mg/l，六水合硫酸镍1~2mg/l，七水合硫酸铁8~15mg/l，泛酸钙2~4mg/l，四水合氯化锰3~5mg/l，二水合钼酸钠0.04mg/l；溶剂使用6g/l丙酸盐废水完全取代清水配制；

30、所述发酵培养基为：培养基的ph值为6.0～6.5，且包括：葡萄糖60-100g/l，酵母浸粉5～15g/l，硫酸钠5~12g/l，硫酸镁2~4g/l，硫酸铵4~8g/l，氯化钾1~2g/l，氯化钙0.1~0.2g/l，硫酸钾0.5~1g/l，磷酸二氢钾0.5~2g/l，谷氨酸钠15～20g/l，七水合硫酸锌1~5mg/l，六水合氯化钴0.01~0.1mg/l，五水合硫酸铜2~6mg/l，六水合硫酸镍1~2mg/l，七水合硫酸铁8~15mg/l，泛酸钙2~4mg/l，四水合氯化锰3~5mg/l，二水合钼酸钠0.04mg/l，维生素b63-10mg/l、维生素b120.1-0.8mg/l；溶剂使用6g/l丙酸盐废水完全取代清水配制。

31、一种利用如上所述的高效利用丙酸盐的裂殖壶菌且用完全丙酸盐废水取代培养基补料发酵裂殖壶菌积累高价值dha和生物量的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

32、取高效利用丙酸盐的裂殖壶菌，按1％的比例接入6g/l丙酸钠废水完全取代的种子培养基中，28℃，170rpm，培养24h，称为一代，连续培养3代；按10％的比例接种于发酵液，进行发酵，初始转速300rpm，通气量2ppm，温度保持28℃，溶氧为15％~30％；ph控制在6.5~7.0之间，使用预配的酸碱进行ph调控，每12h取样测葡萄糖浓度，发酵罐中葡萄糖浓度保持在30g/l以上，连续培养120h；

33、所述方法中使用到的酸、碱和糖也使用6g/l丙酸废水作为溶剂进行配制，酸为一水柠檬酸，碱为氢氧化钠；

34、所述发酵液的配方为：ph值为6.0～6.5，且包括：葡萄糖60-100g/l，酵母浸粉5～15g/l，硫酸钠5~12g/l，硫酸镁2~4g/l，硫酸铵4~8g/l，氯化钾1~2g/l，氯化钙0.1~0.2g/l，硫酸钾0.5~1g/l，磷酸二氢钾0.5~2g/l，谷氨酸钠15～20g/l，七水合硫酸锌1~5mg/l，六水合氯化钴0.01~0.1mg/l，五水合硫酸铜2~6mg/l，六水合硫酸镍1~2mg/l，七水合硫酸铁8~15mg/l，泛酸钙2~4mg/l，四水合氯化锰3~5mg/l，二水合钼酸钠0.04mg/l，维生素b63-10mg/l、维生素b120.1-0.8mg/l，溶剂使用6g/l丙酸盐废水完全取代清水配制，115℃灭菌30分钟，冷却。

35、本发明取得的有益效果是：

36、1、本发明在裂殖壶菌培养的基础上，采用适应性实验室进化手段，获得了一株高耐受丙酸盐废水的裂殖壶菌菌株，该菌株能够高效利用丙酸盐，且获得的菌株在以丙酸盐废水为溶剂的培养基中能同时积累生物量和生产dha。

37、2、本发明得到的裂殖壶菌菌株，在完全丙酸盐废水培养基中培养，裂殖壶菌的抗氧化能力和类胡萝卜素积累能力明显增强。

38、3、本发明使用丙酸盐废水完全配制培养基，裂殖壶菌的生物量积累和dha合成能力显著增强，这为该菌株工业化代谢丙酸废水提供了理论基础。

39、4、本发明分解并利用丙酸废水的裂殖壶菌获得方法。这对未来裂殖壶菌利用丙酸废水改善环境和产品开发具有重要的意义。

40、5、本发明适应性获得高耐受丙酸盐的裂殖壶菌菌株。面包房废水中的丙酸盐浓度为2.4g/l，但是煤气化废水中丙酸盐浓度很高，部分可达10g/l。因此，用2,4,6,8g/l丙酸盐废水完全取代培养基对裂殖壶菌进行适应性驯化，本发明采用裂殖壶菌(schizochytriumsp.cctccm209059）为原始菌株，通过适应性实验室进化手段得到一株高效分解代谢丙酸的裂殖壶菌菌株，为微生物代谢利用丙酸废水改善环境和产品开发具有重要的意义。