一种用于实时监测细胞内氧化还原稳态动力学的双功能、可逆、定量和高尔基靶向荧光探针

背景技术：

1、细胞内氧化还原稳态对于调节生物体的生理功能(如蛋白质运输、细胞增殖和细胞信号传导)具有重要意义。更具体地说，细胞内氧化氧化还原反应主要发生在主要细胞器中，如线粒体、内质网和高尔基体，到目前为止，线粒体中的细胞内氧化还原得到了很好的研究。然而，很少关注高尔基体(细胞代谢的关键细胞器)中的细胞氧化还原稳态。据报道，次氯酸盐/谷胱甘肽(clo-/gsh)氧化还原循环的动力学与细胞内氧化还原稳态密切相关。过量的clo-会破坏氧化还原平衡，产生细胞氧化应激，导致各种疾病，如急性肺损伤、急性肾损伤、急性肝损伤、阿尔茨海默病和癌症。同时，细胞中最丰富的生物硫醇gsh是clo-的主要清除剂，可维持细胞内氧化还原平衡。因此，实时监测高尔基体中clo-/gsh氧化还原循环的动态，对于了解生物体的病理和生理过程非常重要。

2、作为一种多用途的分子工具，有机荧光探针由于其良好的选择性和高灵敏度、设计灵活性和实时监测能力而日益受到生物医学研究科学家的关注，已经建立了许多荧光探针用于单独检测clo-或gsh。为了研究细胞内clo-/gsh氧化还原稳态，需要同时动态检测这两种物质。两个单独的单功能clo-和gsh探针的物理组合通常无法同时检测clo-和gsh，因为这两个探针表现出不同的细胞摄取并在细胞中具有不同的分布。同时，clo-/gsh氧化还原稳态是动态的，其浓度始终波动。因此，用于监测clo-/gsh氧化还原循环的荧光探针应该是可逆的。最近，有几种“开-关”可逆探针用于检测clo-/gsh氧化还原循环。尽管这些“开-开”探针很有用，但它们易受探针浓度和仪器因素的影响，这对在多变的氧化还原环境中进行可靠的生物成像是不利的。定量荧光探针比“开-关”型更有利，因为前者通过两个独立信号的自校准提高了定量分析的准确性并简化了操作程序。因此，用于监测细胞中clo-/gsh氧化还原循环动态的荧光探针应该是双功能的、可逆的和比率测量的。

3、在本专利中，构建了比率荧光探针双功能、可逆和比率型荧光探针psez-cou-golgi，以检测高尔基体内氧化还原稳态相关的clo-/gsh，用于小鼠急性肺损伤诊断。在clo-存在下，psez部分中的硒(se)原子被氧化为硒氧化物(se＝o)，探针psez-cou-golgi转化为psez-cou-golgi氧化物。由于psez部分的氧化物与psez相比是较弱的电子供体，因此psez-cou-golgi氧化物显示出绿色荧光。在gsh存在下，se＝o被还原为se，并且psez-cou-golgi氧化物可以转化回psez-cou-golgi。当用clo-和gsh连续处理探针psez-cou-golgi时，将观察到红-绿-红荧光变化。探针psez-cou-golgi是监测clo-/gsh氧化还原循环的有用工具。

技术实现思路

1、本发明目的在于针对现有研究的不足，开发出一种用于实时监测细胞内氧化还原稳态动力学的双功能、可逆、定量和高尔基靶向荧光探针，解决了现有探针同时动态检测细胞内clo-/gsh氧化还原稳态的技术难题。所述荧光探针psez cou-golg具有如下结构式：

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3、合成路线如下：

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5、(a)将化合物邻溴苯胺和1-溴-2-碘-4-甲氧基苯溶于甲苯并加入三(二亚苄基丙酮)二钯、1,1'-双(二苯基膦)二茂铁、叔丁醇钠，于120℃回流搅拌18h。冷却至室温后，乙酸乙酯萃取。饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠无水。减压旋干得到粗产品，用柱层析法分离得到无色油状化合物1；

6、(b)将化合物1、碘化亚铜、碘化钠、n、n'-二甲基乙二胺溶于无水二恶烷，110℃下搅拌24小时。冷却至室温后，加入氨水溶液，dcm萃取，无水硫酸钠无水。减压旋干得到粗产品，用柱层析法分离得到棕色油状化合物2；

7、(c)将化合物2、se粉、koh溶于无水dmso，110℃反应24小时。冷却至室温后，dcm萃取，饱和nh4cl溶液洗涤，无水硫酸钠无水。减压旋干得到粗产品，用柱层析法分离得到黄色固体化合物3；

8、(d)将步骤(c)制得化合物3溶于无水dmf中，缓慢加入nah，0℃反应30分钟，然后加入2-二甲基乙醇，在室温下搅拌5小时，冷却至室温，将反应液倒入水中猝灭，二氯甲烷萃取三次，无水硫酸钠无水，减压旋干得到粗产品，再经柱层析分离得到化合物4；

9、(e)将化合物4、dmap和三乙胺溶于无水dcm中，滴加ch3cocl。室温下反应12小时，冷却至室温，将反应液倒入h2o中,dcm萃取三次,无水硫酸钠无水，减压旋干得到粗产品,用柱层析法分离得到化合物5；

10、(f)将pocl3滴加到无水dmf中，0℃下，反应30分钟。然后将化合物5溶于无水dmf中，加入到上述混合物中，80℃下反应6小时，冷却至室温，将反应液倒入水中猝灭。用饱和nahco3水溶液中和，用dcm萃取三次，无水na2so4无水。减压旋干得到粗产品,用柱层析法分离得到化合物6；

11、(g)在-78℃，氩气保护下，将化合物6溶于无水dcm中，加入bbr3，室温下反应12小时。将反应液倒入水中猝灭。用饱和nahco3水溶液中和，用dcm萃取三次，无水na2so4无水。减压旋干得到粗产品,用柱层析法分离得到化合物7；

12、(h)将化合物7、丙二酸二乙酯、哌啶溶于etoh中，回流反应6小时。减压蒸馏除去溶剂，得到粗产物，用柱层析法分离得到化合物8；

13、(i)将化合物8溶于无水thf中，加入4-磺酰基苯甲酰氯和et3n，在室温下反应6小时。减压蒸馏除去溶剂，得到粗产物，用柱层析法分离得到探针psez-cou-golgi。

14、所述步骤(a)中1-溴-2-碘-4-甲氧基苯，邻溴苯胺，三(二亚苄基丙酮)二钯，1,1'-双(二苯基膦)二茂铁，叔丁醇钠的物质的量比为1：1.2：0.05：0.1：1.4。

15、所述步骤(b)中化合物1，碘化亚铜、碘化钠、n、n'-二甲基乙二胺的物质的量比为1：0.1：0.2：4。

16、所述步骤(c)中化合物2，se粉、koh的物质的量比为1：2：4。

17、所述步骤(d)中化合物3、nah，2-二甲基乙醇的物质的量比为1：6.8：1.1。

18、所述步骤(e)中化合物4、dmap、三乙胺、ch3cocl的物质的量比为1：0.1：1.5：1.5。

19、所述步骤(f)中化合物5、pocl3的物质的量比为1：3.6。

20、所述步骤(g)中化合物6、bbr3的物质的量比为1：5.3。

21、所述步骤(h)中化合物7、丙二酸二乙酯的物质的量比为1：1.2。

22、所述步骤(i)中化合物8、4-磺酰基苯甲酰氯的物质的量比为1：4。

23、所述步骤(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)中柱层析采用的洗脱剂分别为(纯己烷)、(纯己烷)、(v己烷:v二氯甲烷＝3:7)、(v石油醚:v二氯甲烷＝1:1)、(v石油醚:v二氯甲烷＝2:1)、(v石油醚:v二氯甲烷＝3:1)、(v石油醚:v二氯甲烷＝2:1)、(v乙酸乙酯:v二氯甲烷＝1:15)、(v石油醚:v二氯甲烷＝2:1)。

24、本发明的荧光探针测试方法如下；将探针分子溶解在乙腈/pbs(3:7,v/v,10mm,ph＝7.40)中，室温下进行测试。可以对clo-/gsh进行定性、定量检测，具体实施方法在实施实例中详细介绍。

25、本发明的荧光探针的响应机理如下：荧光探针psez-cou-golgi，在clo-存在下，psez部分中的硒(se)原子被氧化为硒氧化物(se＝o)，探针psez-cou-golgi转化为psez-cou-golgi氧化物。由于psez部分的氧化物与psez相比是较弱的电子供体，因此psez-cou-golgi氧化物显示出绿色荧光。在gsh存在下，se＝o被还原为se，并且psez-cou-golgi氧化物可以转化回psez-cu-golgi。当用clo-和gsh连续处理探针psez-cou-golgi时，将观察到红-绿-红荧光变化，可以实现clo-/gsh氧化还原循环的检测。

26、本发明的荧光探针母体呈现红色荧光，与clo-完全响应后644nm处红色荧光减弱，514nm处荧光增强，显示绿色荧光；与gsh完全响应后514nm处绿色荧光减弱，644nm处荧光增强。显示荧光探针psez-cu-golgi的荧光强度比(i514nm/i644nm)与clo-/gsh浓度具有良好的线性关系，实现同时响应的效果。

27、本发明所述的探针分子稳定性好，生物相容性好，可以实现高选择性与灵敏性检测高尔基氧化应激中clo-/gsh介导的氧化还原状态动态变化。