特异性清除线粒体基因组（mtDNA）的方法与流程

本技术涉及基因编辑，尤其涉及一种特异性清除线粒体基因组(mtdna)的方法以及bhcas12b的用途。

背景技术：

1、线粒体是人体中的重要能量工厂，为细胞提供生存必须的能量，并参与到众多细胞功能中。线粒体dna为环状dna，存在于线粒体双层脂膜内部，并于此复制、转录，是人类基因组中唯一存在于细胞核以外的组分，其上共有37个基因用以维持线粒体最基本的功能需求。单一细胞内可以同时存在数十至数千个，甚至上万个mtdna，以此维持庞大的功能网络的需求。mtdna的突变、缺失及插入可以引起细胞的功能异常，并引发多种疾病。病灶多见于须要大量能量供应的组织、器官中，如脑、神经系统、心脏、肌肉等。

2、线粒体疾病发生于各个年龄段，而且较多在婴幼儿和青少年时期被发现、诊断。由于mtdna遗传并不符合经典的孟德尔遗传学，即mtdna上的基因并不存在纯合、杂合，因此mtdna突变率往往仅需要在特异组织中达到一个特定的阈值，就可以引发功能异常，进而引发疾病。近年来有越来越多的证据显示mtdna突变与神经退行性疾病、癌症、脑卒中等疾病相关。

3、针对mtdna突变的清除与纠正是潜在的治疗方案，近年来也有相关的报道。基于zfn、talen技术而开发的mtdna编辑技术已经被多个实验室报道。此外使用线粒体定位的限制性内切酶的策略也有少数报道。利用crispr技术的线粒体基因组编辑虽然有被报道，但仍然有很多核心问题没有被回答。

技术实现思路

1、为了解决上述的技术问题，本技术提供了一种特异性清除线粒体基因组(mtdna)的方法，其是通过基因编辑技术例如crispr/bhcas12b基因编辑技术特异性清除生物样本中的线粒体基因组(mtdna)。

2、本技术具体技术方案如下：

3、1.一种特异性清除线粒体基因组(mtdna)的方法，包括：

4、通过基因编辑技术特异性清除生物样本中的线粒体基因组(mtdna)，所述生物样本为细胞、动物胚胎、动物成体、类器官、动物体或人体。

5、2.根据项1所述的方法，其中，所述基因编辑技术为crispr/bhcas12b基因编辑技术。

6、3.根据项2所述的方法，其中，将sgrna导入所述线粒体中以实现对线粒体基因组(mtdna)的编辑，优选所述sgrna具有引导元件，所述引导元件选自rpph1、rp、fd，进一步优选所述引导元件为rp，优选rp的序列为seq id no:42所示。

7、4.根据项3所述的方法，其中，含有引导元件rp的sgrna的序列如seq id no：40或41所示。

8、5.根据项3或4所述的方法，其中，将sgrna与bhcas12b编码核苷酸共同递送至含有线粒体基因组(mtdna)的细胞中。

9、6.根据项2-5中任一项所述的方法，其中，所述bhcas12b是具有线粒体靶向序列(mts)的bhcas12b，优选所述bhcas12b包含与seq id no:2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的氨基酸序列，优选的，所述bhcas12b包含seq id no:2所示的氨基酸序列。

10、7.一种通过crispr/bhcas12b基因编辑技术特异性清除线粒体基因组(mtdna)的方法，包括将含有seq id no:40或seq id no:41所示的sgrna导入所述线粒体基因组内。

11、8.根据项7所述的方法，其中，将所述sgrna和bhcas12b编码核苷酸共同递送至含有线粒体基因组(mtdna)的生物样本中，所述生物样本为细胞、动物胚胎、动物成体、类器官、动物体或人体。

12、9.bhcas12b在制备治疗与线粒体功能障碍相关的疾病的药物中的用途。

13、10.根据项9所述的用途，其中，与线粒体功能障碍相关的疾病为线粒体肌病、糖尿病和耳聋(dad)、莱伯遗传性视神经病(lhon)、leigh综合征、神经病、共济失调、视网膜色素变性和眼脸下垂(narp)、伴有破损性红肌纤维病的肌阵挛型癫病(merrf)、肌肉神经源性胃肠脑病(mngie)、线粒体肌病、脑肌病、乳酸酸中毒、中风样综合征(melas)、kearns sayre综合征(kss)、进行性眼外肌麻痹(peo)、皮尔逊氏综合征、母体遗传性肌病和心肌病(mimyca)、凯氏视神经病变、遗传性痉挛性截瘫、腓骨肌萎缩症、散发性年龄相关神经退行性疾病、帕金森氏病(pd)、阿尔茨海默氏病(ad)、年龄相关性黄斑变性(amd)、糖尿病性视网膜病变、青光眼、家族性神经退行性疾病、家族性pd、家族性ad、亨廷顿氏病、色素性视网膜炎(rp)、斯塔加特氏病、慢性进行性外眼肌麻痹(cpeo)和/或mtdna突变、插入、缺失造成的先天性或后天性疾病。

14、11.根据项9或10所述的用途，其中，所述bhcas12b是具有线粒体靶向序列(mts)的bhcas12b，优选所述bhcas12b包含与seq id no:2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的氨基酸序列，优选的，所述bhcas12b包含seq idno:2所示的氨基酸序列。

15、12.bhcas12b在制备治疗下述疾病的药物中的用途：线粒体肌病、糖尿病和耳聋(dad)、莱伯遗传性视神经病(lhon)、leigh综合征、神经病、共济失调、视网膜色素变性和眼脸下垂(narp)、伴有破损性红肌纤维病的肌阵挛型癫病(merrf)、肌肉神经源性胃肠脑病(mngie)、线粒体肌病、脑肌病、乳酸酸中毒、中风样综合征(melas)、kearns sayre综合征(kss)、进行性眼外肌麻痹(peo)、皮尔逊氏综合征、母体遗传性肌病和心肌病(mimyca)、凯氏视神经病变、遗传性痉挛性截瘫、腓骨肌萎缩症、散发性年龄相关神经退行性疾病、帕金森氏病(pd)、阿尔茨海默氏病(ad)、年龄相关性黄斑变性(amd)、糖尿病性视网膜病变、青光眼、家族性神经退行性疾病、家族性pd、家族性ad、亨廷顿氏病、色素性视网膜炎(rp)、斯塔加特氏病、慢性进行性外眼肌麻痹(cpeo)和/或mtdna突变、插入、缺失造成的先天性或后天性疾病。

16、13.根据项12所述的用途，其中，所述bhcas12b是具有线粒体靶向序列(mts)的bhcas12b，优选所述bhcas12b包含与seq id no:2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的氨基酸序列，优选的，所述bhcas12b包含seq idno:2所示的氨基酸序列。

17、14.一种组合物，其包含sgrna和bhcas12b编码核苷酸，所述sgrna具有引导元件。

18、15.根据项14所述的组合物，其中，所述引导元件选自rpph1、rp、fd，进一步优选所述引导元件为rp，优选rp的序列为seq id no:42所示。

19、16.根据项14或15所述的组合物，其中，含有引导元件rp的sgrna序列如含有引导元件rp的sgrna的序列如seq id no：40或41所示。

20、17.根据项14-16中任一项所述的组合物，其中，所述bhcas12b是具有线粒体靶向序列(mts)的bhcas12b，优选所述bhcas12b包含与seq id no:2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的氨基酸序列，优选的，所述bhcas12b包含seq id no:2所示的氨基酸序列。

21、发明的效果

22、本技术使用基因编辑技术例如crispr/bhcas12b基因编辑技术对线粒体基因组(mtdna)进行特异性清除，bhcas12b蛋白在50℃下具有较好的切割效率，并且能够特异性清除生物样本中的线粒体基因组(mtdna)。