一种破伤风抗毒素生产方法与流程

本公开涉及破伤风抗毒素制备，具体涉及一种破伤风抗毒素生产方法。

背景技术：

1、破伤风抗毒素是一种马抗血清制品，它能中和血液中破伤风梭菌产生的破伤风毒素，缓解破伤风症状和降低病死率。当前破伤风抗毒素的生产工艺主要为破伤风类毒素免疫马匹后采集的血浆经胃蛋白酶消化，后者在igg铰链区二硫键的近羧基端处将其剪切为f(ab')2片段和若干无生物活性的小分子多肽pfc'片段，然后去除大量白蛋白、可溶性杂质及fc片段，最后超滤除盐、浓缩和去小分子蛋白。《中国药典》2015版破伤风抗毒素检验项下f(ab')2含量标准规定预防用及治疗用从2010版的应不低于50％及60％提升到了应不低于60％及70％，同时igg含量也从应不高于10％降低为应不高于5％。可见针对破伤风抗毒素生产工艺的发展现状及其临床使用的局限性，我国现行国家标准提高了对此类生物制品纯化工艺的要求，建议增加柱色谱、免疫吸附等纯化技术和完善酶解工艺。

2、目前，由于破伤风抗毒素为蛋白类制剂，蛋白含量高，如不添加防腐剂，受微生物污染的风险极高，一旦微生物污染在其中繁殖，产生细菌内毒素，注射进人体后引起发热，严重时危及患者生命。因此，我国破伤风抗毒素产品的制剂处方一直含防腐剂成分。我国药典允许添加至破伤风抗毒素制剂中的防腐剂为硫柳汞和间甲酚。硫柳汞是一种含汞的有机化合物，有毒性。间甲酚是一种有毒有机化合物，对皮肤、粘膜有强烈刺激和腐蚀作用。尽管在制剂中防腐剂浓度低，使用较安全，但制剂中防腐剂的毒性问题一直存在争议。防腐剂应用于生物制品(疫苗、抗血清制品)处方中已有60多年历史。目前我国部分疫苗产品已禁止添加防腐剂。由于破伤风抗毒素蛋白含量高，去除防腐剂存在较高污染风险，因此，国内的破伤风抗毒素均含防腐剂。

3、可见，目前破伤风抗毒素的分离纯化方式中，存在使用防腐剂添加的问题，另外，如专利号为“cn201610492044.x”公开的一种无防腐剂的注射用马破伤风免疫球蛋白制剂及其制备方法中，其使用化学药品对igg进行消化及加温变性，以及对f(ab’)2提取，然而，使用化学药品存在无法同时满足高纯度、低成本、高回收率及工业化生产等问题，尤其在处理大量原料时，获得大量且高纯度的破伤风抗毒素的成本很高，无法满足市场供应量。

4、需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于加强对本公开的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。

技术实现思路

1、本公开的目的在于提供一种破伤风抗毒素生产方法及，进而至少在一定程度上克服由于相关技术的限制和缺陷而导致技术问题。

2、本公开的其他特性和优点将通过下面的详细描述变得显然，或部分地通过本公开的实践而习得。

3、根据本公开的第一方面，提供了一种破伤风抗毒素生产方法，包括：

4、获取含有破伤风抗毒素的马血清制品溶液；

5、使用装填有层析填料的亲和层析柱对马血清制品溶液进行层析处理，以对所述马血清制品溶液进行纯化，得到igg溶液；

6、在igg溶液中添加基因工程重组猪(牛)胃蛋白酶，进行水解反应，得到f(ab')2和fc片段，得到水解制品溶液；

7、使用装填有层析填料的亲和层析柱对水解制品溶液进行层析处理，以去除水解制品溶液中不具有生物活性的fc片段，得到层析制品溶液；

8、使用巴斯德灭活法(60℃10小时)或低ph孵放法(ph4.0，24℃，21天)对层析制品溶液进行病毒去除/灭活；

9、采用离子交换层对层析制品溶液进一步纯化，得到f(ab')2制品溶液；

10、对所述f(ab')2制品溶液进行纳滤病毒灭活处理，并将病毒灭活处理后的f(ab')2制品溶液进行超滤浓缩，制得破伤风抗毒素溶液。

11、进一步的，所述层析填料为通过cnbr-activated sepharose偶联ttc片段得到能特异性吸附破伤风抗毒素的层析填料。

12、进一步的，所述igg溶液的纯度不低于85％；

13、步骤使用装填有层析填料的亲和层析柱对马血清制品溶液进行层析处理，以对所述马血清制品溶液进行纯化，得到igg溶液包括：

14、使用平衡液a处理亲和层析柱，其中，所述平衡液a包括：pbs和氯化钠，所述平衡液a的ph值为7.0～8.0；

15、将所述马血清制品溶液上样于亲和层析柱中，再使用洗脱液b洗脱亲和层析柱，获得含有破伤风抗毒素的洗脱液，以完成对所述制品溶液的纯化，得到igg溶液；其中，所述洗脱液b的成分包括：醋酸钠，所述洗脱液b的ph值为3.5～4.5。

16、进一步的，水解反应的参数包括：温度为37℃，时长为1～2h。

17、进一步的，在步骤使用装填有层析填料的亲和层析柱对水解制品溶液进行层析处理，以去除水解制品溶液中不具有生物活性的fc片段，得到层析制品溶液之前，所述方法还包括：

18、使用1m氢氧化钠溶液将水解制品溶液的ph调至7.0～8.0；或

19、使用脱盐柱对水解制品溶液进行脱盐处理，其中脱盐缓冲液为20mm磷酸缓冲液，ph＝7.0～8.0。

20、进一步的，层析制品溶液的纯度不低于95％；

21、步骤使用装填有层析填料的亲和层析柱对水解制品溶液进行层析处理，以去除水解制品溶液中不具有生物活性的fc片段，得到层析制品溶液包括：

22、使用平衡液a处理亲和层析柱，将所述水解制品溶液上样于亲和层析柱中；其中，所述平衡液a的成分包括：pbs和氯化钠，所述平衡液a的ph值为7.0～8.0；

23、使用洗脱液b洗脱亲和层析柱，获得含有破伤风抗毒素的洗脱液，以完成对所述制品溶液的纯化，得到不含有fc片段的层析制品溶液；其中，所述洗脱液b的成分包括：醋酸钠，所述洗脱液b的ph值为3.5～4.5。

24、进一步的，f(ab')2制品溶液的纯度不低于99％；

25、步骤采用离子交换层对层析制品溶液进一步纯化，得到f(ab')2制品溶液包括：

26、使用平衡液c处理亲和层析柱，将所述层析制品溶液上样于亲和层析柱中；其中，所述平衡液c的成分包括：tris和hcl，所述平衡液的ph值为7.0～8.0；

27、使用洗脱液c洗脱亲和层析柱，获得含有破伤风抗毒素的洗脱液，以完成对所述层析制品溶液的纯化；得到f(ab')2制品溶液；其中，所述洗脱液c的成分包括：tris和氯化钠，所述洗脱液c的ph值为7.0～8.0。

28、使用纳滤对f(ab’)2制品溶液进行病毒去除。

29、进一步的，步骤将病毒灭活处理后的f(ab')2制品溶液进行超滤浓缩中，超滤浓缩的浓度范围为：6～10mg/ml。

30、进一步的，所述方法还包括：

31、对所述破伤风抗毒素溶液进行除菌过滤，得到原液；

32、对原液进行检测、配制、除菌、检测、分装，获得破伤风抗毒素成品；其中，检测的指标包括：破伤风抗毒素效价≥2000iu/ml，无菌依法检查指标(通则1101)，异常毒性依法检查指标(通则1141)。

33、根据本公开的第二方面，提供了一种破伤风抗毒素，采用上述的破伤风抗毒素生产方法纯化获得。

34、本公开的一种破伤风抗毒素生产方法，包括：获取含有破伤风抗毒素的马血清制品溶液；使用装填有层析填料的亲和层析柱对马血清制品溶液进行层析处理，以对所述马血清制品溶液进行纯化，得到igg溶液；在igg溶液中添加基因工程重组猪(牛)胃蛋白酶，进行水解反应，得到f(ab')2和fc片段，得到水解制品溶液；使用装填有层析填料的亲和层析柱对水解制品溶液进行层析处理，以去除水解制品溶液中不具有生物活性的fc片段，得到层析制品溶液；采用巴斯德灭活法和/或辛酸低ph孵放法灭活病毒；采用离子交换层对层析制品溶液进一步纯化，得到f(ab')2制品溶液；对所述f(ab')2制品溶液进行纳滤病毒灭活处理，并将病毒灭活处理后的f(ab')2制品溶液进行超滤浓缩，制得破伤风抗毒素溶液。

35、相较于现有技术，本技术使用含有亲和物质的层析填料吸附蛋白溶液中的破伤风抗毒素，并调整适宜的条件使破伤风抗毒素解吸附，以对所述制品溶液进行纯化，重组的胃蛋白酶消化所得制品溶液，进一步纯化获得高纯度、高质量、高效价破伤风抗毒素，实现了破伤风抗体效价的富集。通过本工艺生产的破伤风抗毒素，蛋白纯度更高、血浆综合利用率达到提升、经过两步病毒灭活、无防腐剂添加，提升了产品质量，提高了破伤风抗毒素市场供给量。

36、应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开。