一种鲟鱼卵巢抗氧化肽的制备方法

本发明属于食品营养与健康和水产品高值化利用领域，具体涉及一种鲟鱼卵巢抗氧化肽的制备方法。

背景技术：

1、机体正常呼吸作用中会产生自由基(ros)(如羟基自由基(·oh)和超氧阴离子自由基(o2-))，而产生的自由基又在机体生理活动过程中发挥着重要的调节作用，如调控细胞增殖、凋亡和信号传导等。正常情况下，过量的自由基会被内源性抗氧化防御系统(超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)、谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)等)和体内的非酶抗氧化系统(抗坏血酸、生育酚、胡萝卜素等)清除，因此自由基的产生和消除处于一个平衡的状态。但当自由基产生过多或机体抗氧化系统受损时，这种平衡会被打破。此外，大量的研究发现过量的自由基可以直接或间接破坏细胞内重要生物分子(蛋白质，脂质，dna和碳水化合物等)并导致机体氧化应激，进而促进组织炎症和慢性疾病的产生，如癌症、动脉粥样硬化、阿尔兹海默症和骨质疏松等。

2、当内源性抗氧化剂和修复系统不能有效降低机体内自由基的量的时候，可以利用外源性抗氧化剂通过向自由基提供电子或氢原子形成复合物的方式缓解或限制机体氧化应激，降低疾病发生率。常见的人工合成的抗氧化剂包括丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯、丁基羟基甲苯和叔丁基氢醌等，具有高效和成本低的优点，但潜在的毒副作用限制了其在食品工业中的应用。而天然的抗氧化剂(多肽类，多糖类，多酚类，维生素类等)除了具有高效和成本低的特点，还具有来源广泛，易吸收，可长期使用且无明显毒副作用的特点，近年来受到了广泛的关注。

3、鱼类资源丰富，且鱼肉中蛋白质含量高，一直是生物活性肽的优质原料。除了可食用部分，其它的副产物中也有含量相当的蛋白，油脂等物质。如何用成熟低廉的手段从中提取高价值的鱼油、多肽等活性物质也同样成为了当今研究的焦点。鲟鱼(acipenser)，隶属于硬属鱼纲、鲟鱼形，是一类具有生物和经济重要性的鱼类。鲟鱼因鱼子酱与鱼皮而闻名，但鲟鱼鱼肉硬度较大，口感较柴，因此鲟鱼肉连带着其他副产物往往被丢弃，并没有得到高价值利用，造成了极大的浪费。所以，如何让对鲟鱼副产物进行高价值利用是目前急需解决的技术问题。

4、目前对于鲟鱼卵巢中功能活性物质的研究国内外未有文献报道，因此，开发最优酶解纯化工艺，优化抗氧化肽活性的评价方法，是制备鲟鱼卵巢抗氧化肽至关重要的环节。

技术实现思路

1、目前对于鲟鱼卵巢中功能活性物质的研究国内外未有文献报道，关于如何制备鲟鱼卵巢抗氧化肽，其酶解、纯化工艺、优化抗氧化肽活性，是制备鲟鱼卵巢抗氧化肽至关重要的环节。

2、针对存在的技术问题，本发明以鲟鱼卵巢为原料，从酶解法水解鲟鱼卵巢获得抗氧化肽角度切入，采用传统分离纯化与生物信息学联用的技术，提供一种简单高效的鲟鱼抗氧化肽制备方法，并筛选出两条具有抗氧化活性的鲟鱼卵巢蛋白肽，为其它副产物利用方式提供可行方案，并为其作为功能性产品在食品药品行业中的应用提供了可行途径。

3、本发明首先提供一种鲟鱼卵巢抗氧化肽，包括两种多肽，其氨基酸序列为：

4、phe-asp-trp-asp-arg-leu；

5、phe-glu-gly-pro-pro-phe-lys-phe。

6、本发明还提供一种鲟鱼卵巢抗氧化肽的制备方法，具体步骤如下：

7、(1)鲟鱼卵巢去鱼籽，洗净沥干，经斩拌处理得到糜状物；并通过凯氏定氮法测定鲟鱼卵巢中粗蛋白含量；

8、(2)将步骤(1)中糜状物加入蒸馏水后，经超声处理后得到混合液，调节混合液的ph后再加入碱性蛋白酶进行恒温水浴酶解，酶解后再经灭酶处理，处理后冷却至室温，经离心取上清液进行真空冷冻干燥，得粉末状鲟鱼卵巢蛋白酶解物；

9、(3)超滤：采用超滤膜对(2)中得到的粉末状鲟鱼卵巢蛋白酶解物进行分级分离，获得组分，经冷冻干燥处理，得到冻干后的组分；

10、(4)sephadex g-25凝胶柱纯化：对步骤(3)中冻干后的组分进行纯化，蒸馏水洗脱，收集洗脱液，经冷冻干燥处理，得到冻干后的组分；

11、(5)制备型反相液相色谱柱纯化：对(4)中冻干后的组分进一步纯化，纯化后，利用洗脱液线性梯度洗脱，收集组分，经冷冻干燥处理，最终得到鲟鱼卵巢抗氧化肽。

12、优选的，步骤(2)中，糜状物与蒸馏水的用量比为1g:3ml；调节混合液的ph是利用1mol/l naoh调节ph至10.0。

13、优选的，步骤(2)中，超声处理为置于37℃水浴腔中，调节三频超声频率为25/50/75hz，超声功率为240w，超声模式设为10s开10s关，超声时间为30min。

14、优选的，步骤(2)中，根据凯氏定氮测得的糜状物中粗蛋白含量，根据蛋白的用量按照4000u/g加入碱性蛋白酶进行酶解。

15、优选的，步骤(2)中，恒温水浴酶解的条件为：温度50℃，酶解时间为240min。

16、优选的，步骤(2)中，灭酶处理的条件为：95℃灭酶15min。

17、优选的，步骤(2)中，离心的条件为10000r/min，10-15min。

18、优选的，步骤(3)中，超滤膜分级超滤的截留分子量(mw)为100kda、10kda和3kda；分离出四种不同mw的多肽组分分别为：mw>100kda，10kda<mw<100kda,3kda<mw<10kda，mw<3kda。

19、优选的，步骤(4)中，凝胶柱层析所用填料为sephadex g-25，层析条件为：柱：sephadex g-25凝胶柱，柱规格1.6cm×60cm，柱温：室温，流速：1ml/min，样品浓度：25mg/ml，进样量：2.0-5.0ml，检测波长：280nm，洗脱液：蒸馏水。

20、优选的，步骤(5)中，制备型反相液相色谱柱，柱规格21.2cm×250mm；流动相选择甲醇和去离子水，洗脱参数为：0.01-20min，10％甲醇；20-20.01min，50％甲醇；20.01-40min：50％甲醇；40-40.01min：10％甲醇；40.01-45min：10％甲醇；柱温：室温，流速：5ml/min，样品浓度：200mg/ml，进样量：1.5ml，检测波长：280nm。

21、抗氧化活性的检测方法为建立h2o2损伤的mc3t3-e1细胞损伤模型，通过cck-8法测细胞活力。

22、抗氧化肽的筛选方法：

23、s1.lc-ms/ms鉴定肽序：利用nano-hplc液相系统ulti mate 3000rslcnano(thermo fisher scientific)分离后用q-exactive plus质谱仪(thermo fisherscientific)对上述步骤(5)中获得的组分进行质谱分析；获得的质谱数据使用软件maxquant进行分析并将所得多肽序列与uniprot-acipenser数据库进行对比，得出肽序列的蛋白来源；

24、s2.抗氧化肽筛选：利用pertideranker软件对步骤s1所得多肽进行活性预测评分，并将评分高的肽段使用zdock软件进行肽段与受体蛋白对接，并最终确定目的肽序列。

25、s3.多肽合成及活性验证：对s2步骤中筛选出的肽序列进行合成，并通过细胞毒性和细胞活力实验验证其抗氧化潜能，并最终得到具有抗氧化潜能的两种多肽。

26、优选的，生物信息学分析技术包括利用maxquant软件及鲟鱼数据库(uniprot-acipenser)联合质谱结果分析，使用peptideranker软件对多肽进行活性预测评分；使用zdock软件进行肽段与受体蛋白对接，最终确定目的肽段序列；使用biopep-uwm(http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep)软件对目的肽段的创新性进行评估。

27、优选的，步骤s2中，筛选出的具有抗氧化潜能的两种多肽的氨基酸序列为：phe-asp-trp-asp-arg-leu；phe-glu-gly-pro-pro-phe-lys-phe。

28、优选的，步骤s3中，所述细胞毒性具体操作为：当肽处理组细胞活力等于或高于空白组细胞活力时(p＞0.05)，认为该肽无明显细胞毒性；所述细胞活性具体操作为：建立h2o2诱导mc3t3-e1细胞氧化损伤模型，当肽处理组细胞活性等于或低于模型组(h2o2组)细胞活力时(p＞0.05)，认为该肽不具备抗氧化活性。

29、上述步骤中抗氧化活性测定包括：建立h2o2诱导mc3t3-e1细胞氧化损伤模型，cck-8法测定细胞活力。

30、cck-8法测定细胞活力：mc3t3-e1细胞在含有10％胎牛血清和1％双抗的α-mem培养基中培养。细胞融合度达80％进行消化传代。待细胞达到80％融合度时，以5×104个/ml密度铺在96孔板中培养24h，后加入不同浓度多肽组分继续培养24h即铺板48h后，加入400μmol/l h2o2进行细胞损伤模型诱导4h，后续细胞活力用cck-8试剂盒测定。

31、本发明有益的技术效果在于：

32、(1)与现在有关于制备活性多肽的方法相比，本发明制备工艺简单、成本低、条件温和，有效地保持了鲟鱼肽的抗氧化活性，且制备方法成熟，技术稳定可靠。

33、(2)本发明通过计算机模拟软件进行定向结合多肽的虚拟筛选，不仅减少实际筛选强度，还提高了筛选成功的几率；通过在线多肽数据库检索，筛选后的多肽序列并未被论文报导过，提高了鲟鱼卵巢抗氧化肽的创新性。

34、(3)本发明首次利用鲟鱼卵巢得到两种新型的多肽序列；得到的抗氧化肽扩大了鲟鱼的应用范围，既可以解决鲟鱼的高值化利用问题，又能作为一种功能性因子应用于功能性产品当中，具有开发新的保健食品的潜力。