体外无细胞多酶体系合成腺苷钴胺素的方法

本发明属于酶催化领域，具体涉及无细胞多酶催化合成腺苷钴胺素的方法以及腺苷钴胺素合成中间产物的酶法制备方法。

背景技术：

1、腺苷钴胺素(维生素b12，adenosylcobalamin,adocbl)是自然界中存在的最复杂的含金属的天然化合物之一，只能由原核动物从头合成。维生素b12是真核动物生命活动中必须的维生素之一，在细胞代谢中起重要作用，特别是在dna合成，甲基化修饰和线粒体代谢中(r.green,l.h.allen,a.l.et al.vitamin b(12)deficiency.nat revdis primers.2017jun 29；3:17040)。钴胺素主要包括腺苷钴胺素，氰基钴胺素(cyanocobalamin,cncbl)，羟基钴胺素(hydroxocobalamin,ohcbl)和甲基钴胺素(methylcobalamin,mecbl)。其中腺苷钴胺素是原核生物天然合成的活性形式之一，也称为辅酶b12。腺苷钴胺素的化学结构包括一个中心钴啉环、上配体腺苷基团和下配体5,6-二甲基苯并咪唑基团(5,6-dimethylbenzimidazole,dmbi)。

2、由于化学合成法过程复杂，操作繁琐，目前维生素b12的生产依赖于微生物发酵法。工业生产维生素b12主要应用的菌株为脱氮假单胞菌(pseudomonas denitrifican)，费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(propionibacteriumshermanii)和苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobium meliloti)等。另外，新型重组菌株如大肠杆菌(escherichia coli)也已经实现了维生素b12的代谢合成改造。

3、传统维生素b12工业生产菌株存在发酵周期长，培养基成分复杂，和代谢改造困难等特点。新型重组维生素b12合成菌株存在产量较低，异源基因协调较为困难等特点。因此，维生素b12的产量在近三十年未有明显的提升，本领域迫切需要开发新型的合成策略以高效合成维生素b12。

4、体外无细胞多酶催化技术，相较于经典的代谢工程改造技术有诸多优化之处。体外无细胞多酶催化体系由催化酶和所需辅因子构成，高效催化底物进行级联反应，合成目标产物。和逐步进行遗传操作的代谢工程改造对比，无细胞多酶催化系统具有调节方式灵活，分离和纯化产物高效且简便，对中间产物或终产物的积累毒性耐受性高和高的催化效率等特点(y.h.zhang.production of biofuels and biochemicals by in vitrosynthetic biosystems:opportunities and challenges.biotechnol adv.2015nov 15；33(7):1467-83；j.u.bowie,s.sherkhanov,t.p.korman,et al.synthetic biochemistry:the bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production.trendsbiotechnol,2020,38:766-778)。

技术实现思路

1、为改善现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用5-氨基酮戊酸(5-ala)为底物，经过多酶催化合成腺苷钴胺素的方法，所述多酶包含：

2、胆色素原合成酶，胆色素原脱氨酶，尿卟啉原iii合成酶，尿卟啉原iii甲基转移酶，前咕啉-2甲基转移酶，前咕啉3b合成酶，前咕啉3b甲基转移酶，前咕啉4甲基转移酶，前咕啉5甲基转移酶，前咕啉6a还原酶，前咕啉6b甲基转移酶，前咕啉8x甲基转移酶，氢咕啉酸a,c-二酰胺合成酶，钴鳌合酶，钴啉酸a,c-二酰胺还原酶，钴啉醇酰胺腺苷转移酶，腺苷钴啉胺酸合成酶，l-苏氨酸激酶，苏氨酸-磷酸脱羧酶，腺苷钴啉醇酰胺磷酸合成酶，钴啉醇酰胺磷酸鸟苷酸转移酶，烟酸盐-核苷酸-二甲基苯并咪唑磷酸核糖转移酶，腺苷钴胺素-5’磷酸合成酶，腺苷钴胺素磷酸酶；

3、进一步的，为解决反应体系中nadh供给问题，谷氨酰胺供给问题，atp供给问题，sam供给问题，sah积累问题，多聚磷酸积累问题，所述方法还包括将l-谷氨酸转化为5-氨基酮戊酸，nadh的步骤，其中该催化步骤由谷氨酸脱氢酶，戊邻酮二酸盐脱氢酶复合体和5-氨基酮戊酸合成酶进行催化；将l-谷氨酸转化为l-谷氨酰胺，该催化步骤由谷氨酰胺合成酶进行催化；将amp，adp转化为atp，该催化步骤由多聚磷酸激酶进行催化；将三磷酸，焦磷酸转化为磷酸，该催化步骤由无机焦磷酸酶进行催化；将l-甲硫氨酸转化为s-腺苷甲硫氨酸的步骤，该催化步骤由甲硫氨酸腺苷转移酶进行催化；将s-腺苷高半胱氨酸转化为s-核糖高半胱氨酸，该催化步骤由s-腺苷-l高半胱氨酸水解酶进行催化；将s-腺苷高半胱氨酸转化为s-核苷高半胱氨酸，该催化步骤由s-腺苷高半胱氨酸核苷酶催化；将腺苷转化为amp，该催化步骤由腺苷激酶进行催化；将高半胱氨酸转化为l-甲硫氨酸，该催化步骤由高半胱氨酸s-甲基转移酶和甲硫氨酸s-甲基转移酶进行催化。

4、采用上述以5-氨基酮戊酸为底物，多酶催化合成的方法，本发明进一步提供了一系列维生素b12及其合成中间产物，包括氢咕啉酸，腺苷钴啉酸a,c-二酰胺，腺苷钴啉胺酸，腺苷钴胺素的制备方法。

5、本发明提供一种体外多酶催化反应，催化5-氨基酮戊酸制备氢咕啉酸的方法：

6、以5-氨基酮戊酸为底物，加入胆色素原合成酶，胆色素原脱氨酶，尿卟啉原iii合成酶，尿卟啉原iii甲基转移酶，前咕啉-2甲基转移酶，前咕啉3b合成酶，前咕啉3b甲基转移酶，前咕啉4甲基转移酶，前咕啉5甲基转移酶，前咕啉6a还原酶，前咕啉6b甲基转移酶，前咕啉8x甲基转移酶，建立多酶催化反应体系，进行酶催化反应。

7、优选的，为避免s-腺苷甲硫氨酸的自身降解，在反应体系中加入甲硫氨酸腺苷转移酶，以从l-甲硫氨酸合成s-腺苷甲硫氨酸，代替直接添加s-腺苷甲硫氨酸；

8、优选的，为防止s-腺苷高半胱氨酸积累，在反应体系中加入腺苷高半胱氨酸核苷酶，以降解腺苷高半胱氨酸。更优的，腺苷高半胱氨酸核苷酶可以替换为以下酶组合：s-腺苷高半胱氨酸酶，多聚磷酸激酶，腺苷激酶，高半胱氨酸s-甲基转移酶，甲硫氨酸s-甲基转移酶。

9、优选的，为再生nadh和5-氨基酮戊酸，加入谷氨酸脱氢酶，戊邻酮二酸盐脱氢酶复合体和5-氨基酮戊酸；

10、优选实施方式中，在一个反应体系中，5-氨基酮戊酸的浓度分别为1-1000mm，s-腺苷甲硫氨酸的浓度为1-1000mm，l-甲硫氨酸的浓度为1-1000mm，胆色素原合成酶的用量为0.1-1000μm,胆色素原脱氨酶的用量为0.1-1000μm,尿卟啉原iii合成酶的用量为0.1-1000μm，尿卟啉原iii甲基转移酶的用量为0.1-1000μm，前咕啉-2甲基转移酶的用量为0.1-1000μm，前咕啉3b合成酶的用量为0.1-1000μm，前咕啉3b甲基转移酶的用量为0.1-1000μm，前咕啉4甲基转移酶的用量为0.1-1000μm，前咕啉5甲基转移酶的用量为0.1-1000μm，前咕啉6a还原酶的用量为0.1-1000μm，前咕啉6b甲基转移酶的用量为0.1-1000μm，前咕啉8x甲基转移酶的用量为0.1-1000μm，s-腺苷高半胱氨酸酶的用量为0.1-1000μm，甲硫氨酸腺苷转移酶的用量为0.1-1000μm，s-腺苷高半胱氨酸酶的用量为0.1-1000μm，多聚磷酸激酶的用量为0.1-1000μm，腺苷激酶的用量为0.1-1000μm，高半胱氨酸s-甲基转移酶的用量为0.1-1000μm，甲硫氨酸s-甲基转移酶的用量为0.1-1000μm，谷氨酸脱氢酶的用量为0.1-1000μm，戊邻酮二酸盐脱氢酶复合体的用量为0.1-1000μm，5-氨基酮戊酸的用量为0.1-1000μm。

11、优选的，5-氨基酮戊酸的浓度为5mm,l-甲硫氨酸的浓度为3mm，胆色素原合成酶的用量为0.1μm,胆色素原脱氨酶的用量为0.1μm,尿卟啉原iii合成酶的用量为1μm，尿卟啉原iii甲基转移酶的用量为10μm，前咕啉-2甲基转移酶，s-腺苷高半胱氨酸酶的用量为10μm；甲硫氨酸腺苷转移酶的用量为9μm，s-腺苷高半胱氨酸酶的用量为9μm，多聚磷酸激酶的用量为9μm，腺苷激酶的用量为9μm，高半胱氨酸s-甲基转移酶的用量为3μm，甲硫氨酸s-甲基转移酶的用量为10μm，谷氨酸脱氢酶的用量为5μm，戊邻酮二酸盐脱氢酶复合体的用量为15μm，5-氨基酮戊酸的用量为5μm。

12、在优选的实施方案中，前咕啉-2甲基转移酶，前咕啉3b合成酶，前咕啉3b甲基转移酶，前咕啉4甲基转移酶，前咕啉5甲基转移酶，前咕啉6a还原酶，前咕啉6b甲基转移酶和前咕啉8x甲基转移酶，以上八个酶分别以相应表达菌株的粗细胞提取液形式，进行催化组合使用，以避免酶处理过程中因为蛋白纯化步骤而造成的酶失活现象，且简化操作步骤；戊邻酮二酸盐脱氢酶复合体中三个单独的酶ec 3.4.24.59,ec 1.2.4.2,ec 1.8.1.4的编码基因以rbs的强度比例为1：6：12串联表达于一个大质粒中，三酶共同纯化，以简化操作步骤。

13、更优的，将前咕啉-2甲基转移酶，前咕啉3b合成酶，前咕啉3b甲基转移酶，前咕啉4甲基转移酶，前咕啉5甲基转移酶，前咕啉6a还原酶，前咕啉6b甲基转移酶和前咕啉8x甲基转移酶的编码基因串联表达于一个大质粒中，进行共表达，将重组菌的粗细胞提取物作为混合酶，进行催化合成，用量为60000od600/l反应液。

14、所述酶催化反应体系在20-60℃下进行，反应时间为0.3-100小时。

15、上述所述多酶催化反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，钠盐，钾盐，还原剂，nadh，nadph，多聚磷酸盐，磷酸核苷。

16、优选的，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为6.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm，镁盐为氯化镁，浓度为0.01-500mm,钠盐为氯化钠，浓度为0.01-500mm,钾盐为氯化钾，浓度为0.01-500mm，还原剂为二硫苏糖醇，浓度为1mm，nadh的浓度为200mg/l，nadph的浓度为200mg/l，多聚磷酸盐为六偏磷酸钠，浓度为2mm，磷酸核苷为单磷酸腺苷，浓度为0.2mm；

17、本发明也提供一种体外多酶催化反应，催化氢咕啉酸制备腺苷咕啉酸a,c-二酰胺的方法：以氢咕啉酸为底物，加入氢咕啉酸a,c-二酰胺合成酶，钴鳌合酶，钴啉酸a,c-二酰胺还原酶，钴啉醇酰胺腺苷转移酶，建立多酶催化反应体系，进行酶催化反应。

18、优选的，为消除反应体系中积累的多磷酸副产物，在催化反应体系中加入无机焦磷酸酶，将多磷酸降解为磷酸；优选的，为加强还原反应的进行，在催化反应体系中加入nadh-黄素还原酶，加强还原型辅因子的供给。优选的，为设置atp的再生，在催化反应体系中加入多聚磷酸激酶；

19、优选的，为避免反应体系中钴螯合反应和还原反应条件不兼容的问题，先以氢咕啉酸为底物，加入氢咕啉酸a,c-二酰胺合成酶，钴鳌合酶，多聚磷酸激酶催化合成钴啉酸a,c-二酰胺，再加入钴啉酸a,c-二酰胺还原酶，nadh-黄素还原酶，钴啉醇酰胺腺苷转移酶，合成腺苷咕啉酸a,c-二酰胺；

20、优选的，在存在钴啉酸a,c-二酰胺还原酶催化反应的体系中加入还原剂，且在厌氧条件下进行。更优选的，还原剂选用二硫苏糖醇，浓度为1mm。

21、在一个反应体系中，氢咕啉酸的浓度为1-1000μm，氢咕啉酸a,c-二酰胺合成酶的用量为1-1000μm，钴鳌合酶cobn的用量为1-1000μm，钴鳌合酶cobs-cobt的用量为1-1000μm，钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的用量为1-1000μm，钴啉酸腺苷转移酶的用量为1-1000μm，无机焦磷酸酶的用量为为1-1000μm，nadh-黄素还原酶的用量为1-1000μm，多聚磷酸激酶的用量为1-1000μm，nadh-黄素还原酶的用量为1-1000μm。

22、优选的，氢咕啉酸的浓度为30μm，氢咕啉酸a,c-二酰胺合成酶的用量为9μm，钴鳌合酶cobn的用量为45μm，钴鳌合酶cobs-cobt的用量为30μm，钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的用量为90μm，钴啉酸腺苷转移酶的用量为30μm，多聚磷酸激酶的用量为9μm，nadh-黄素还原酶的用量为9μm，无机焦磷酸酶的用量为90μm。

23、所述酶催化反应体系在20-60℃，反应时间为0.3-100小时。

24、上述所述多酶催化反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，钠盐，钾盐，谷氨酰胺，钴盐，聚磷酸，腺苷二磷酸，腺苷三磷酸，nadph,nadh，黄素核苷酸。

25、优选的，缓冲液为mops缓冲液，缓冲液的ph为6.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm，镁盐为氯化镁，浓度为0.01-500mm,钠盐为氯化钠，浓度为0.01-500mm,钾盐为氯化钾，浓度为0.01-500mm，l-谷氨酰胺的浓度为1-1000mm,钴盐为氯化钴，浓度为0.05-100mm，聚磷酸为六偏磷酸钠(smpp)，浓度为1-1000mm，单磷酸腺苷(amp)的浓度为1 -1000mm，三磷酸腺苷(atp)的浓度为1-1000mm，nadph的浓度为1-1000mm，nadh的浓度为1-1000mm，黄素核苷酸为黄素单核苷酸(fmn)，浓度为1-1000mm。

26、本发明还提供一种体外多酶催化反应，催化氢咕啉酸制备腺苷钴啉胺酸的方法：以氢咕啉酸为底物，加入氢咕啉酸a,c-二酰胺合成酶，钴鳌合酶，钴啉酸a,c-二酰胺还原酶，钴啉醇酰胺腺苷转移酶，腺苷钴啉胺酸合成酶，建立多酶催化反应体系，进行酶催化反应。

27、优选的，为消除反应体系中积累的多磷酸副产物，在催化反应体系中加入无机焦磷酸酶，将多磷酸降解为磷酸。

28、优选的，为加强还原反应的进行，在催化反应体系中加入nadh-黄素还原酶，加强还原型辅因子的供给；

29、优选的，为设置atp的再生，在催化反应体系中加入多聚磷酸激酶；

30、优选的，为设置谷氨酰胺的再生，在催化反应体系中加入谷氨酰胺合成酶；

31、优选的，为避免反应体系中钴螯合反应和还原反应条件不兼容的问题，先以氢咕啉酸为底物，先加入氢咕啉酸a,c-二酰胺合成酶，钴鳌合酶，多聚磷酸激酶催化合成钴啉酸a,c-二酰胺，再加入钴啉酸a,c-二酰胺还原酶，nadh-黄素还原酶，钴啉醇酰胺腺苷转移酶，腺苷钴啉胺酸合成酶，合成腺苷钴啉胺酸。

32、优选的，在存在钴啉酸a,c-二酰胺还原酶催化反应的体系中加入还原剂，且在厌氧条件下进行。更优选的，还原剂选用二硫苏糖醇，浓度为1mm。

33、在一个反应体系中，氢咕啉酸的浓度为1-1000μm，氢咕啉酸a,c-二酰胺合成酶的用量为1-1000μm，钴鳌合酶cobn的用量为1-1000μm，钴鳌合酶cobs-cobt的用量为1-1000μm，钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的用量为1-1000μm，钴啉酸腺苷转移酶的用量为1-1000μm，多聚磷酸激酶的用量为1-1000μm，nadh-黄素还原酶的用量为1-1000mm，无机焦磷酸酶的用量为1-1000μm，谷氨酰胺合成酶的用量为1-1000μm，腺苷钴啉胺酸合成酶的用量为1-1000μm。

34、优选的，氢咕啉酸的浓度为30μm，氢咕啉酸a,c-二酰胺合成酶的用量为9μm，钴鳌合酶cobn的用量为45μm，钴鳌合酶cobs-cobt的用量为30μm，钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的用量为90μm，钴啉酸腺苷转移酶的用量为30μm，多聚磷酸激酶的用量为9μm，nadh-黄素还原酶的用量为9μm，无机焦磷酸酶的用量为90μm，谷氨酰胺合成酶的用量为10μm，腺苷钴啉胺酸合成酶的用量为90μm。

35、所述酶催化反应体系在20-60℃，反应时间为0.3-100小时。

36、上述所述多酶催化反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，钠盐，钾盐，谷氨酰胺，钴盐，聚磷酸，腺苷二磷酸，腺苷三磷酸，nadph,nadh，黄素核苷酸。

37、优选的，缓冲液为mops缓冲液，缓冲液的ph为6.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm，镁盐为氯化镁，浓度为0.01-500mm,钠盐为氯化钠，浓度为0.01-500mm,钾盐为氯化钾，浓度为0.01-500mm，l-谷氨酰胺的浓度为1-1000mm,钴盐为氯化钴，浓度为0.05-100mm，聚磷酸为六偏磷酸钠，浓度为1-1000mm，单磷酸腺苷的浓度为1 -1000mm，三磷酸腺苷的浓度为1-1000mm，nadph的浓度为1-1000mm，nadh的浓度为1-1000mm，黄素核苷酸为黄素单核苷酸，浓度为1-1000mm。

38、本发明还提供一种体外多酶催化反应，催化5-氨基酮戊酸制备腺苷钴胺素的方法：

39、以5-氨基酮戊酸为底物，加入胆色素原合成酶，胆色素原脱氨酶，尿卟啉原iii合成酶，尿卟啉原iii甲基转移酶，前咕啉-2甲基转移酶，前咕啉3b合成酶，前咕啉3b甲基转移酶，前咕啉4甲基转移酶，前咕啉5甲基转移酶，前咕啉6a还原酶，前咕啉6b甲基转移酶，前咕啉8x甲基转移酶，氢咕啉酸a,c-二酰胺合成酶，钴鳌合酶，钴啉酸a,c-二酰胺还原酶，钴啉醇酰胺腺苷转移酶，腺苷钴啉胺酸合成酶，l-苏氨酸激酶，苏氨酸-磷酸脱羧酶，腺苷钴啉醇酰胺磷酸合成酶，钴啉醇酰胺磷酸鸟苷酸转移酶，烟酸盐-核苷酸-二甲基苯并咪唑磷酸核糖转移酶，腺苷钴胺素-5’磷酸合成酶，腺苷钴胺素磷酸酶，建立多酶催化反应体系，进行酶催化反应。

40、优选的，为避免s-腺苷甲硫氨酸的自身降解，在反应体系中加入甲硫氨酸腺苷转移酶，以从l-甲硫氨酸合成s-腺苷甲硫氨酸；

41、优选的，为防止s-腺苷高半胱氨酸积累，在反应体系中加入腺苷高半胱氨酸核苷酶，以降解腺苷高半胱氨酸。更优的，腺苷高半胱氨酸核苷酶可以替换为以下酶组合：s-腺苷高半胱氨酸酶，多聚磷酸激酶，腺苷激酶，高半胱氨酸s-甲基转移酶，甲硫氨酸s-甲基转移酶。

42、优选的，为再生nadh和5-氨基酮戊酸，加入谷氨酸脱氢酶，戊邻酮二酸盐脱氢酶复合体和5-氨基酮戊酸合成酶；优选的，为加强还原反应的进行，在催化反应体系中加入nadh-黄素还原酶，加强还原型辅因子的供给；优选的，为设置atp的再生，在催化反应体系中加入多聚磷酸激酶；优选的，为设置谷氨酰胺的再生，在催化反应体系中加入谷氨酰胺合成酶；优选的，为防止聚磷酸的积累，加入无机焦磷酸酶，催化聚磷酸分解为正磷酸；

43、优选的，s-腺苷甲硫氨酸作为底物投入替换为l-甲硫氨酸作为底物投入；

44、优选的，在存在钴啉酸a,c-二酰胺还原酶催化反应的体系中加入还原剂，且在厌氧条件下进行。更优选的，还原剂选用二硫苏糖醇，浓度为1mm；

45、优选的，为避免反应途径过长，多步酶催化反应相互竞争及影响的问题，将一锅反应更改为5-氨基酮戊酸至氢咕啉酸反应，氢咕啉酸到腺苷钴胺素反应的两锅连续反应；更优的，为更好的避免反应体系中钴螯合反应和还原反应条件不兼容的问题，将一锅反应改为5-氨基酮戊酸至氢咕啉酸反应，氢咕啉酸到钴啉酸a,c-二酰胺反应，钴啉酸a,c-二酰胺反应到腺苷钴胺素反应的三锅连续反应。

46、在一个反应体系中，5-氨基酮戊酸的浓度为1-100mm，s-腺苷甲硫氨酸的浓度为1-100mm，胆色素原合成酶的用量为1-1000μm，胆色素原脱氨酶的用量为1-1000μm，尿卟啉原iii合成酶的用量为1-1000μm，尿卟啉原iii甲基转移酶的用量为1-1000μm，前咕啉-2甲基转移酶的用量为1-1000μm，前咕啉3b合成酶的用量为1-1000μm，前咕啉3b甲基转移酶的用量为1-1000μm，前咕啉4甲基转移酶的用量为1-1000μm，前咕啉5甲基转移酶的用量为1-1000μm，前咕啉6a还原酶的用量为1-1000μm，前咕啉6b甲基转移酶的用量为1-1000μm，前咕啉8x甲基转移酶的用量为1-1000μm，氢咕啉酸a,c-二酰胺合成酶的用量为1-1000μm，钴鳌合酶cobn的用量为1-1000μm，钴鳌合酶cobs-cobt的用量为1-1000μm，钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的用量为1-1000μm，钴啉酸腺苷转移酶的用量为1-1000μm，多聚磷酸激酶的用量为1-1000μm，nadh-黄素还原酶的用量为1-1000mm，无机焦磷酸酶的用量为1-1000μm，腺苷钴啉胺酸合成酶的用量为1-1000μm，l-苏氨酸激酶的用量为1-1000μm，苏氨酸-磷酸脱羧酶的用量为1-1000μm，腺苷钴啉醇酰胺磷酸合成酶的用量为1-1000μm，钴啉醇酰胺磷酸鸟苷酸转移酶的用量为1-1000μm，烟酸盐-核苷酸-二甲基苯并咪唑磷酸核糖转移酶的用量为1-1000μm，腺苷钴胺素-5’磷酸合成酶的用量为1-1000μm，腺苷钴胺素磷酸酶的用量为1-1000μm，谷氨酸脱氢酶的用量为1-1000μm，谷氨酰胺合成酶的用量为1-1000μm，5-氨基酮戊酸合成酶的用量为1-1000μm，2-戊邻酮二酸盐脱羧酶复合体的用量为1-1000μm。

47、优选的，5-氨基酮戊酸的浓度为3mm，s-腺苷甲硫氨酸的浓度为1mm，胆色素原合成酶的用量为6.8μm，胆色素原脱氨酶的用量为1.5μm，尿卟啉原iii合成酶的用量为2.0μm，尿卟啉原iii甲基转移酶的用量为10μm，前咕啉-2甲基转移酶，前咕啉3b合成酶的用量，前咕啉3b甲基转移酶，前咕啉4甲基转移酶，前咕啉5甲基转移酶，前咕啉6a还原酶，前咕啉6b甲基转移酶，前咕啉7甲基转移酶，前咕啉8x甲基转移酶用共表达底盘细胞的细胞粗提液，用量为40od600/ml，氢咕啉酸a,c-二酰胺合成酶的用量为9μm，钴鳌合酶cobn的用量为45μm，钴鳌合酶cobs-cobt的用量为30μm，钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的用量为90μm，钴啉酸腺苷转移酶的用量为30μm，多聚磷酸激酶的用量为9μm，nadh-黄素还原酶的用量为9μm，无机焦磷酸酶的用量为90μm，腺苷钴啉胺酸合成酶的用量为90μm，l-苏氨酸激酶的用量为20μm，苏氨酸-磷酸脱羧酶的用量为20μm，腺苷钴啉醇酰胺磷酸合成酶的用量为20μm，钴啉醇酰胺磷酸鸟苷酸转移酶的用量为50μm，烟酸盐-核苷酸-二甲基苯并咪唑磷酸核糖转移酶的用量为20μm，腺苷钴胺素-5’磷酸合成酶的用量为20μm，腺苷钴胺素磷酸酶的用量为100μm，谷氨酸脱氢酶的用量为3μm，谷氨酰胺合成酶的用量为5μm，5-氨基酮戊酸合成酶的用量为5μm，2-戊邻酮二酸盐脱羧酶复合体的用量为10μm。

48、所述酶催化反应体系在20-60℃，厌氧环境下进行，反应时间0.3-100小时。

49、上述所述多酶催化反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，钠盐，钾盐，谷氨酰胺，钴盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸，腺苷三磷酸，nadph,nadh，黄素核苷酸，鸟苷三磷酸，l-苏氨酸，甘氨酸，维生素b6，5，6-二甲基苯并咪唑，牛血清白蛋白。

50、优选的，缓冲液为mops缓冲液，缓冲液的ph为6.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm，镁盐为氯化镁，浓度为0.01-500mm,钠盐为氯化钠，浓度为0.01-500mm,钾盐为氯化钾，浓度为0.01-500mm，l-谷氨酰胺的浓度为1-1000mm,钴盐为氯化钴，浓度为0.05-100mm，锰盐为氯化锰，浓度为0.01-10mm，聚磷酸为六偏磷酸钠，浓度为1-1000mm，腺苷二磷酸的浓度为1-1000mm，腺苷三磷酸的浓度为1-1000mm，nadph的浓度为1-1000mm，nadh的浓度为1-1000mm，黄素核苷酸为黄素单核苷酸，浓度为1-1000mm，鸟苷三磷酸的浓度为1 -1000mm，l-苏氨酸的浓度为1 -1000mm，甘氨酸的浓度为1 -1000mm，维生素b6为磷酸吡哆醇，浓度为1-1000mm，5,6-二甲基苯并咪唑的浓度为1 -1000mm，牛血清蛋白的浓度为0.1-50mg/l。

51、(5)提供一种体外多酶催化反应，催化氢咕啉酸制备腺苷钴胺素的方法：

52、以氢咕啉酸为底物，加入氢咕啉酸a,c-二酰胺合成酶，钴鳌合酶，钴啉酸a,c-二酰胺还原酶，钴啉醇酰胺腺苷转移酶，腺苷钴啉胺酸合成酶，l-苏氨酸激酶，苏氨酸-磷酸脱羧酶，腺苷钴啉醇酰胺磷酸合成酶，钴啉醇酰胺磷酸鸟苷酸转移酶，烟酸盐-核苷酸-二甲基苯并咪唑磷酸核糖转移酶，腺苷钴胺素-5’磷酸合成酶，腺苷钴胺素磷酸酶，建立多酶催化反应体系，进行酶催化反应。

53、优选的，为加强还原反应的进行，在催化反应体系中加入nadh-黄素还原酶，加强还原型辅因子的供给；优选的，为设置atp的再生，在催化反应体系中加入多聚磷酸激酶；优选的，为设置谷氨酰胺的再生，在催化反应体系中加入谷氨酰胺合成酶；优选的，为防止聚磷酸的积累，加入无机焦磷酸酶，催化聚磷酸分解为正磷酸；

54、优选的，为避免反应体系中钴螯合反应和还原反应条件不兼容的问题，先以氢咕啉酸为底物，先加入氢咕啉酸a,c-二酰胺合成酶，钴鳌合酶，多聚磷酸激酶催化合成钴啉酸a,c-二酰胺，再加入其余酶，合成腺苷钴胺素。

55、优选的，在存在钴啉酸a,c-二酰胺还原酶催化反应的体系中加入还原剂，且在厌氧条件下进行。更优选的，还原剂选用二硫苏糖醇，浓度为1mm。

56、在一个反应体系中，氢咕啉酸的浓度为1-1000μm，氢咕啉酸a,c-二酰胺合成酶的用量为1-1000μm，钴鳌合酶cobn的用量为1-1000μm，钴鳌合酶cobs-cobt的用量为1-1000μm，钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的用量为1-1000μm，钴啉酸腺苷转移酶的用量为1-1000μm，多聚磷酸激酶的用量为1-1000μm，nadh-黄素还原酶的用量为1-1000mm，无机焦磷酸酶的用量为1-1000μm，腺苷钴啉胺酸合成酶的用量为1-1000μm，l-苏氨酸激酶的用量为1-1000μm，苏氨酸-磷酸脱羧酶的用量为1-1000μm，腺苷钴啉醇酰胺磷酸合成酶的用量为1-1000μm，钴啉醇酰胺磷酸鸟苷酸转移酶的用量为1-1000μm，烟酸盐-核苷酸-二甲基苯并咪唑磷酸核糖转移酶的用量为1-1000μm，腺苷钴胺素-5’磷酸合成酶的用量为1-1000μm，腺苷钴胺素磷酸酶的用量为1-1000μm。

57、优选的，氢咕啉酸的浓度为40μm，氢咕啉酸a,c-二酰胺合成酶的用量为9μm，钴鳌合酶cobn的用量为45μm，钴鳌合酶cobs-cobt的用量为30μm，钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的用量为90μm，钴啉酸腺苷转移酶的用量为30μm，多聚磷酸激酶的用量为9μm，nadh-黄素还原酶的用量为9μm，无机焦磷酸酶的用量为90μm，腺苷钴啉胺酸合成酶的用量为90μm，l-苏氨酸激酶的用量为30μm，苏氨酸-磷酸脱羧酶的用量为30μm，腺苷钴啉醇酰胺磷酸合成酶的用量为20μm，钴啉醇酰胺磷酸鸟苷酸转移酶的用量为95μm，烟酸盐-核苷酸-二甲基苯并咪唑磷酸核糖转移酶的用量为20μm，腺苷钴胺素-5’磷酸合成酶的用量为20μm，腺苷钴胺素磷酸酶的用量为59μm。

58、所述酶催化反应体系在20-60℃，厌氧环境下进行，反应时间0.3-100小时。

59、上述所述多酶催化反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，钠盐，钾盐，谷氨酰胺，钴盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸，腺苷三磷酸，nadph,nadh，黄素核苷酸，鸟苷三磷酸，l-苏氨酸，甘氨酸，维生素b6，5，6-二甲基苯并咪唑，牛血清白蛋白。

60、优选的，缓冲液为mops缓冲液，缓冲液的ph为6.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm，镁盐为氯化镁，浓度为0.01-500mm,钠盐为氯化钠，浓度为0.01-500mm,钾盐为氯化钾，浓度为0.01-500mm，l-谷氨酰胺的浓度为1-1000mm,钴盐为氯化钴，浓度为0.05-100mm，锰盐为氯化锰，浓度为0.01-10mm，聚磷酸为六偏磷酸钠(smpp)，浓度为1-1000mm，腺苷二磷酸(amp)的浓度为1 -1000mm，腺苷三磷酸(atp)的浓度为1-1000mm，nadph的浓度为1-1000mm，nadh的浓度为1-1000mm，黄素核苷酸为黄素单核苷酸(fmn)，浓度为1-1000mm，鸟苷三磷酸的浓度为1 -1000mm，l-苏氨酸的浓度为1 -1000mm，甘氨酸的浓度为1 -1000mm，维生素b6为磷酸吡哆醇，浓度为1 -1000mm，5,6-二甲基苯并咪唑的浓度为1 -1000mm，牛血清蛋白的浓度为0.1-50mg/l。

61、本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液等；各种镁盐、钠盐和钾盐均可用于本发明，例如硫酸镁、氯化镁、硫酸钠、氯化钠、硫酸钾、氯化钾等；各种还原剂均可用于本发明，例如β-巯基乙醇，二硫苏糖醇，谷胱甘肽等；各种磷酸核苷均可用于本发明，例如单磷酸腺苷，二磷酸腺苷，三磷酸腺苷等；各种黄素核苷酸均可用于本发明，例如黄素单核苷酸(fmn)，黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)等；各种维生素b6可以用于本发明，例如磷酸吡哆醇，磷酸吡哆醛，磷酸吡哆胺等。

62、本发明所述的酶可以为任意具有相同功能的酶，也可以是通过蛋白质工程改造获得的具有同等功能的突变酶。

63、所述胆色素原合成酶包括但不限于：eschericia coli，sinorhizobiummeliloti，rhosobacter capsulatus等，优选为来源于sinorhizobium meliloti的胆色素原合成酶。所述胆色素原脱氨酶包括但不限于：eschericia coli，propionibacteriumfreudenreichiis,sinorhizobium meliloti等，优选为来源于sinorhizobium meliloti的胆色素原脱氨酶。所述尿卟啉原iii合成酶包括但不限于：eschericia coli，sinorhizobium meliloti等，优选为来源于sinorhizobium meliloti的尿卟啉原iii合成酶。所述尿卟啉原iii合成酶包括但不限于：eschericia coli，pseudomonasdenitrificans，rhosobacter capsulatus等，优选为来源于rhosobacter capsulatus的尿卟啉原iii甲基转移酶。所述前咕啉-2甲基转移酶包括但不限于：rhosobactercapsulatus，sinorhizobium meliloti等，优选为来源于rhosobacter capsulatus的尿卟啉原iii甲基转移酶。所述前咕啉3b合成酶包括但不限于：rhosobacter capsulatus，pseudomonas denitrificans，brucella melitensis等，优选为来源于brucellamelitensi的前咕啉3b合成酶。所述前咕啉3b甲基转移酶包括但不限于：rhosobactercapsulatus，sinorhizobium meliloti等，优选为来源于rhosobacter capsulatus的前咕啉3b甲基转移酶。所述前咕啉4甲基转移酶包括但不限于：rhosobacter capsulatus，sinorhizobium meliloti等，优选为来源于rhosobacter capsulatus的前咕啉4甲基转移酶。所述前咕啉5甲基转移酶包括但不限于：rhosobacter capsulatus，sinorhizobiummeliloti等，优选为来源于rhosobacter capsulatus的前咕啉5甲基转移酶。所述前咕啉6a还原酶包括但不限于：rhosobacter capsulatus，sinorhizobiummeliloti等，优选为来源于rhosobacter capsulatus的前咕啉6a还原酶。所述前咕啉6b甲基转移酶包括但不限于：rhosobacter capsulatus，sinorhizobium meliloti等，优选为来源于rhosobactercapsulatus的前咕啉6b甲基转移酶。所述前咕啉8甲基转移酶包括但不限于：rhosobactercapsulatus，sinorhizobium meliloti等，优选为来源于rhosobacter capsulatus的前咕啉8x甲基转移酶。所述氢咕啉酸a,c-二酰胺合成酶包括但不限于：rhosobactercapsulatus，sinorhizobium meliloti等，优选为来源于rhosobacter capsulatus的前咕啉8x甲基转移酶。所述的钴鳌合酶包括但不限于：brucella melitensis，sinorhizobiummeliloti等，优选为来源于brucella melitensis的cobn与sinorhizobium melilot的cobst的钴鳌合酶组合。所述的钴啉酸a,c-二酰胺还原酶包括但不限于：brucellamelitensis，sinorhizobiummeliloti等，优选为来源于brucella melitensis的钴啉酸a,c-二酰胺还原酶。所述的钴啉醇酰胺腺苷转移酶包括但不限于：pseudomonasdenitrificans，salmonella typhimurium等，优选为来源于salmonella typhimurium的钴啉醇酰胺腺苷转移酶。所述的多聚磷酸激酶包括但不限于：escherichia coli,corynebacterium glutamicum等，优选为来源于corynebacterium glutamicum的多聚磷酸激酶。所述的nadh-黄素还原酶包括但不限于：escherichia coli,rhodococcusrhodochrous等，优选为来源于escherichia coli的nadh-黄素还原酶。所述的无机焦磷酸酶包括但不限于：escherichia coli,sinorhizobium meliloti等，优选为来源于escherichia coli的无机焦磷酸酶。所述的腺苷钴啉胺酸合成酶包括但不限于：pseudomonas denitrificans,salmonella typhimurium等，优选为来源于salmonellatyphimurium的腺苷钴啉胺酸合成酶。所述的l-苏氨酸激酶包括但不限于：salmonellatyphimurium，cereibactersphaeroides等，优选为来源于salmonella typhimurium的l-苏氨酸激酶。所述的苏氨酸-磷酸脱羧酶包括但不限于：pseudomonas denitrificans,salmonella typhimurium等，优选为来源于pseudomonas denitrificans的苏氨酸-磷酸脱羧酶。所述的腺苷钴啉醇酰胺磷酸合成酶包括但不限于：pseudomonas denitrificans,propionibacterium freudenreichii等，优选为来源于propionibacteriumfreudenreichii的腺苷钴啉醇酰胺磷酸合成酶。所述的钴啉醇酰胺磷酸鸟苷酸转移酶包括但不限于：escherichia coli,salmonella typhimurium等，优选为来源于escherichiacoli的钴啉醇酰胺磷酸鸟苷酸转移酶。所述的烟酸盐-核苷酸-二甲基苯并咪唑磷酸核糖转移酶包括但不限于：escherichia coli,salmonella typhimurium等，优选为来源于escherichia coli的烟酸盐-核苷酸-二甲基苯并咪唑磷酸核糖转移酶。所述的腺苷钴胺素-5’磷酸合成酶包括但不限于：escherichia coli,salmonella typhimurium等，优选为来源于escherichia coli的腺苷钴胺素-5’磷酸合成酶。所述的腺苷钴胺素磷酸酶包括但不限于：escherichia coli,salmonella typhimurium等，优选为来源于escherichia coli的腺苷钴胺素磷酸酶。所述的谷氨酸脱氢酶包括但不限于：escherichia coli,bacillussubtilis等，优选为来源于bacillus subtilis的谷氨酸脱氢酶。所述的谷氨酰胺合成酶包括但不限于：escherichia coli,bacillus subtilis等，优选为来源于escherichia coli的谷氨酰胺合成酶。所述的5-氨基酮戊酸合成酶包括但不限于：escherichia coli,rhodobacter sphaeroides等，优选为来源于rhodobacter sphaeroides的5-氨基酮戊酸合成酶。所述的2-戊邻酮二酸盐脱羧酶复合体包括但不限于：escherichia coli,homosapiens等，优选为来源于escherichia coli的2-戊邻酮二酸盐脱羧酶复合体。所述的甲硫氨酸腺苷转移酶包括但不限于：bacillus subtilis，escherichia coli，rhodobactersphaeroides等，优选为来源于rhodobacter sphaeroides的甲硫氨酸腺苷转移酶。所述的腺苷激酶包括但不限于：arabidopsis thaliana col，homo sapiens等，优选为来源于arabidopsis thaliana col的腺苷激酶。所述的腺苷高半胱氨酸酶包括但不限于corynebacterium glutamicum，pseudomonas aeruginosa等，优选为来源于pseudomonasaeruginosa的腺苷高半胱氨酸酶。所述的高半胱氨酸s甲基转移酶包括但不限于escherichia coli，arabidopsis thaliana col等，优选为来源于escherichia coli的高半胱氨酸s甲基转移酶。所述的甲硫氨酸s甲基转移酶包括但不限于arabidopsis thalianacol，wollastoniabiflora等，优选为来源于arabidopsis thaliana col的甲硫氨酸s甲基转移酶。