一种糖肽类抗生素可视化检测的生物传感器及其构建方法与应用

本发明属于合成生物学与生物工程，具体涉及一种糖肽类抗生素可视化检测的生物传感器及其构建方法与应用。

背景技术：

1、糖肽类抗生素，如万古霉素与瑞斯西丁素，一直是临床上治疗由革兰氏阳性菌，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)感染的首选抗生素。然而，糖肽类抗生素的不合理使用导致其耐药性日益严重，20世纪80年代在临床上首次发现，并分离了耐万古霉素的肠球菌(vre)。面对日益严峻的抗生素耐药性问题，临床上迫切需要药理学性质更加突出的糖肽类抗生素。然而由于糖肽类抗生素化学结构的复杂性，使得通过化学全合成的方式合成新型糖肽类抗生素衍生物变得极具挑战性。

2、随着高通量测序技术的飞速发展，在已测序的放线菌基因组中，科学家们发现了大量未知的糖肽类抗生素生物合成基因簇，这些海量的微生物天然宝库蕴含着大量的新型糖肽类天然产物，它们可以作为临床上糖肽类药物及先导化合物的重要来源。然而，传统的微生物药物研发模式及天然产物检测方法大多受限于复杂的样品预处理过程、昂贵的检测器材(如高效液相色谱)与检测效率低下等缺点，因而更为高效的糖肽类抗生素筛选系统的建立对于新型糖肽类抗生素的持续挖掘至关重要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种糖肽类抗生素可视化检测的生物传感器及其构建方法与应用，从而解决上述现有技术存在的问题。

2、为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案:

3、第一方面，本发明提供了一种糖肽类抗生素可视化检测的生物传感器的构建方法，通过在模式菌株天蓝色链霉菌m1146中，对其染色体上d-丙氨酸-d-丙氨酸连接酶编码基因ddla进行定点突变，并以突变后的菌株为底盘宿主、以受糖肽类抗生素诱导的双组分系统(vans/vanr)中所包含的特异性调控元件pvanhax为报告基因启动子、以d-丙氨酸-d-乳酸连接酶编码基因vana为报告基因，构建得到糖肽类抗生素全细胞生物传感器。

4、作为本发明的一个实施方案，所述d-丙氨酸-d-丙氨酸连接酶编码基因ddla来源于天蓝色链霉菌m1146，基因序列如seq id no.1所示。

5、作为本发明的一个实施方案，所述双组分系统vans/vanr来源于天蓝色链霉菌m1146，由vans、vanr、vanj、vank、vanh、vana、vanx共7个基因组成。

6、作为本发明的一个实施方案，所述特异性调控元件pvanhax来源于天蓝色链霉菌m1146，dna序列如seq id no.2所示。

7、作为本发明的一个实施方案，所述报告基因vana来源于天蓝色链霉菌m1146，基因序列如seq id no.3所示。

8、作为本发明的一个实施方案，所述方法包括以下步骤：

9、s1、在大肠杆菌中构建用于定点突变天蓝色链霉菌m1146中d-丙氨酸-d-丙氨酸连接酶编码基因ddla的质粒；

10、s2、将所述质粒经酶切及测序验证后，通过大肠杆菌-链霉菌的属间接合转移转入至天蓝色链霉菌m1146中，经抗生素筛选及pcr验证获得d-丙氨酸-d-丙氨酸连接酶编码基因ddla定点突变菌株，即为糖肽类抗生素可视化检测的生物传感器。

11、步骤s1中，所述突变天蓝色链霉菌m1146中d-丙氨酸-d-丙氨酸连接酶编码基因ddla是通过将基因ddla的活性位点氨基酸ser357突变为ile实现的。

12、所述质粒pmutddla的构建是在质粒pjtu1278的双酶切位点saci与ecori间，分别插入特定的左右同源臂片段mutddla-l与mutddla-r；且同源臂片段mutddla-l两端酶切位点为saci与aani；同源臂片段mutddla-r两端酶切位点为aani与ecori。其中pjtu1278为大肠杆菌-链霉菌属间接合转移常用质粒，包含了接合转移所需的所有元件，在文献he y,wang z,bai l,liang j,zhou x,deng z.two phz1358-derivative vectors forefficient gene knockout in streptomyces.j microbiol biotechnol.2010；20(4):678-682.doi:10.4014/jmb.0910.10031中曾报道。

13、同源臂片段mutddla-l的dna序列如seq id no.4所示；同源臂片段mutddla-r的dna序列如seq id no.5所示。扩增同源臂mutddla-l所采用的引物为：

14、正向引物mutddla-l-f:5′-gagctccaagggctccctcatcaccc-3′seq id no.6，

15、反向引物mutddla-l-r:5′-ttataatcggcgtgaagccgggcatggt-3′seq id no.7；

16、扩增同源臂mutddla-r所采用的引物为：

17、正向引物mutddla-r-f:5′-ttataatgtacccgcagatgtggcag-3′seq id no.8，

18、反向引物mutddla-r-r:5′-gaattcggtgagcacccactgcatgg-3′seq id no.9；

19、其中，5′端起前5位字母序列为酶切位点序列。

20、第二方面，本发明提供了上述构建方法构建得到的糖肽类抗生素可视化检测的生物传感器。

21、第三方面，本发明提供了一种d-丙氨酸-d-丙氨酸连接酶编码基因ddla定点突变菌株，天蓝色链霉菌streptomyces coelicolor m1146-why01，其保藏编号为cgmccno.26432。

22、本发明以糖肽类抗生素代表药物“万古霉素”为例，通过平板法确定生物传感器why01对万古霉素的检测限为0.75μg/ml。当ms固体培养基中添加的万古霉素终浓度大于或等于0.75μg/ml时，why01均能够正常生长，一旦培养基中添加的万古霉素终浓度大幅度地低于0.75μg/ml时，why01生长受到非常明显的限制。通过平板法所建立的糖肽类抗生素筛选系统具有操作简单、廉价与可视化等优点，且其检测限极低，尤其适合对痕量的糖肽类抗生素进行定性检测。

23、第四方面，本发明提供了一种糖肽类抗生素可视化检测的生物传感器或菌株why01在糖肽类抗生素检测中的应用，通过将所述生物传感器或菌株why01的生长状态与pvanhax启动子的激活进行偶联，使得所述生物传感器或菌株why01仅能在含有糖肽类抗生素的培养基下存活。这一生长特性使得通过直接观察why01的存活状态即可对样品中糖肽类抗生素残留及含有糖肽类抗生素的微生物药物进行定性检测。

24、所述糖肽类抗生素可以诱导vanb型vans/vanr双组分系统，包括万古霉素、a47934、a82846b与瑞斯西丁素。

25、为了进一步比较本发明所述的糖肽类生物传感器why01与高效液相色谱仪检出限的差异，本发明以糖肽类抗生素代表药物“万古霉素”为例，对不同浓度的万古霉素与其对应的色谱峰面积进行线性拟合作图分析，得到相关关系公式为：y＝2.627*x+0.8851，r2＝1.000；其中，x为万古霉素浓度(μg/ml)，y为色谱峰面积。之后利用响应值标准偏差与标准曲线斜率法计算高效液相色谱仪对万古霉素的检出限为4.11μg/ml，该检出限为本发明所涉及的生物传感器why01检出限的5.5倍。

26、本发明涉及的ddla定点突变菌株天蓝色链霉菌m1146-why01，已经保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，拉丁文学名为streptomyces coelicolor，保藏日期为2023年1月9日，保藏编号为cgmcc no.26432。

27、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

28、以糖肽类抗生素代表药物“万古霉素”为例，相比于现有的高效液相色谱检测法，本发明提供的生物传感器不仅省去了繁琐的样品预处理步骤，且检测限下降了5.5倍，低至0.75μg/ml，具有检测价格便宜、检测限更低、检测流程简单等优点，不仅可应用于糖肽类抗生素残留的高通量可视化初筛，在微生物药物筛选方面也具有巨大潜力。