菌株及其在制备泰乐菌素A中的应用

本发明涉及基因工程和微生物。

背景技术：

1、泰乐菌素是由弗氏链霉菌(streptomyces fradiae)产生的一类大环内酯类抗生素(参见文献hamill rl,haney me jr.stamper m and wiley pf.tylosin,a newantibiotic.ii.isolation,properties,and preparation of desmycosin,amicrobiologically active degradation product.antibiot chemother(northfield),1961,11:328-334)。由于对多种革兰氏阳性细菌、部分革兰氏阴性细菌、弯曲杆菌、螺旋体、支原体等具有很强的抑制作用，并且对幼龄期和生长期畜禽具有良好的促生长作用，因此泰乐菌素已经被广泛应用于畜禽类疾病防治或作为促生长的饲料添加剂(参见文献poulsen sm,kofoed c,vester b.inhibition of the ribosomal peptidyl transferasereaction by the mycarose moiety of the antibiotics carbomycin,spiramycin andtylosin.journal of molecular biology.2000,304(3):471-481)。

2、从结构上看，泰乐菌素由一个十六元内酯环结构(泰乐内酯)连接1-3个糖基组成的多组分抗生素(参见文献morin rb,gorman m,hamill rl,demarco pv.the structureof tylosin.tetrahedron lett.1970,54:4737-4740)。其中，泰乐菌素a在泰乐内酯的c-4位连接一个由碳霉氨基糖(mycaminose)和碳霉糖(mycarose)组成的二糖单元，在c-23位连接一个2，3-二甲基-6-脱氧-d-阿洛糖(mycinose)；与泰乐菌素a相比，泰乐菌素b的内酯环c-4位只连接一个碳霉氨基糖，而泰乐菌素c的6-脱氧-d-阿洛糖上只存在一个c-2位甲基化。为了提高泰乐菌素的药效以及应对大环内酯类抗生素耐药菌的问题，在泰乐菌素的基础上，科学家们又通过化学和生物学方法开发出了乙酰异戊酰泰乐菌素、替米考星等抗生素(参见文献okamoto r,tsuchiya m,nomura h,iguchi h,kiyoshima k,hori s,inui t,sawa t,takeuchi t,umezawa h.biological properties of new acyl derivatives oftylosin.the journal of antibiotics.1980；33(11):1309-1315；ose ee.in vitroantibacterial properties of el-870,a new semi-synthetic macrolideantibiotic.the journal of antibiotics..1987,40(2):190-194)。

3、泰乐菌素的生物合成机制已经初步阐明(参见文献baltz rh,seno et,stonesifer j,wild gm.biosynthesis of the macrolide antibiotic tylosin apreferred pathway from tylactone to tylosin.the journal of antibiotics.1983,36(2):131-141)。在弗氏链霉菌中，泰乐菌素生物合成基因簇大小约86kb，含有44个编码基因(参见文献cundliffe e,bate n,butler a,fish s,gandecha a,merson-davies l.thetylosin-biosynthetic genes of streptomyces fradiae.antonie vanleeuwenhoek.2001,79(3-4):229-234)。其中，由tylgi-gv编码的i型聚酮合酶负责泰乐菌素中十六元内酯环的合成。tylgi-gv形成的i型聚酮合酶含有1个起始模块和7个延伸模块。起始模块中的酰基转移酶(at)特异性识别丙酰辅酶a并将其转移到酰基载体蛋白(acp)上，成为泰乐菌素生物合成的起始单元。随后起始单元被转移到第一个延伸模块的β-酮基硫酯合成酶(ks)上，与这个模块酰基转移酶所识别的底物甲基丙二酰辅酶a缩合形成β-酮结构从而完成第一轮延伸。其他六个延伸模块采用类似的机理将前体碳链与3个甲基丙二酰辅酶a、2个丙二酰辅酶a和1个乙基丙二酰辅酶a缩合，形成十六碳骨架的前体碳链。最后在硫酯酶(te)的作用下，前体碳链从acp上水解下来并环化形成泰乐内酯结构。泰乐内酯经过一系列的糖基化、羟基化、醛基化和甲基化等修饰，最终形成多种结构的泰乐菌素。

4、泰乐菌素作为一类重要的抗生素已经被广泛用于畜禽养殖业。目前，泰乐菌素主要是利用弗氏链霉菌进行发酵生产。提高生产菌株中泰乐菌素的合成能力对于降低生产成本、提高生产企业的竞争力极为重要。然而，经过几十年的发展，通过传统的物理化学诱变方法进行高产菌株育种筛选已经很难再进一步提高泰乐菌素的产量。随着分子生物学和代谢工程等学科的发展，利用基因工程手段进行菌种的定向改造为泰乐菌素的产量提高提供了新的希望。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种基因在构建产泰乐菌素a的链霉菌中的应用，所述基因包括：强启动子和ovmfgih基因。

2、在本发明的具体实施例中，所述强启动子为phrdb启动子、perme*启动子或pkaso*启动子；所述phrdb启动子序列如序列表seq id no:4所示。

3、在本发明的具体实施例中，所述ovmfgih基因包括ovmh基因、ovmg基因、ovmi基因和ovmf基因；所述ovmh基因的氨基酸序列如序列表seq id no:1；所述ovmg基因的氨基酸序列如序列表seq id no:2；所述ovmi基因的氨基酸序列如序列表seq id no:3；所述ovmf基因的氨基酸序列如序列表seq id no:8。

4、在本发明的具体实施例中，所述链霉菌为弗氏链霉菌atcc 19609。

5、本发明还提供了一种构建工程菌wt/fgih的方法，包括：通过大肠杆菌et12567将重组大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒导入弗氏链霉菌atcc 19609中；所述重组大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒的构建方法是将两个pcr产物phrdb和ovmfgih与经过noti和ecor v双酶切的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒进行连接；所述pcr产物phrdb的构建方法是以天蓝色链霉菌m1146的基因组为模板，用引物152-ph f/phrdb r进行pcr扩增；所述pcr产物ovmfgih的构建方法是以圈卷产色链霉菌7100的基因组为模板，用引物ph-ovmf f/ovmh-152r进行pcr扩增。

6、在本发明的具体实施例中，所述大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒为pset152、pkc1139或pij10500。

7、本发明提供了泰乐菌素高产工程菌株及其构建方法。本发明利用强启动子(如链霉菌看家基因hrdb的启动子)驱动乙酰辅酶a羧化酶基因和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因的高表达，构建了重组工程菌株wt/fgih，重组工程菌中泰乐菌素的产量是其出发菌株2倍左右。