一种长双歧杆菌及其应用

本发明涉及微生物，尤其是涉及一种长双歧杆菌及其应用，具体涉及一种长双歧杆菌及其在制备纳米载药系统中的应用。

背景技术：

1、在过去的半个世纪里，由于对癌症生物学的深入了解、手术效果的改善以及越来越有效的多模式化疗和放疗方案，癌症患者的生存期显著提高。细胞毒性药物仍然是大多数晚期疾病患者的主要治疗手段，但它们的治疗反应不可预测，且与治疗相关的发病率和死亡率相当高。

2、下一代个性化、安全性好、副作用小的癌症治疗方法正在出现，免疫检查点(ici)治疗就是其中的代表。ici疗法改变了传统的癌症治疗策略，打破了肿瘤放化疗治疗格局，使实体转移性恶性肿瘤的治疗取得了突破。目前已经发现的免疫检查点有程序性细胞死亡1(pd-1)及其配体(pd-l1)、淋巴细胞激活基因-3(lag3)、细胞毒性t淋巴细胞相关抗原-4(ctla-4)等，这些免疫检查点的阻断能够释放免疫制动反应并有效抑制肿瘤免疫逃逸。

3、然而，ici治疗的反应是异质性的，相关报道显示ici治疗患者客观缓解率仅为10％-30％，也就说明有相当大的一部分患者人群对ici的治疗存在不响应的情况，这严重降低了ici的临床使用价值。决定患者是否应答ici治疗的因素究竟是什么，这一难题长期以来困扰着研究人员。随着肠道微生物组学与生信分析技术的发展，肠道菌群与ici治疗异质性开始被联系起来，为改善抗肿瘤免疫反应和扩大ici功效提供了新的见解。但是复杂肠道微生物组的每个组成部分的具体功能和分子机制在很大程度上仍然未知。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种长双歧杆菌及其在制备纳米载药系统中的应用。本发明通过筛选出一株新的长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)sysu10可以与免疫检查点抑制剂联用发挥协同抗肿瘤效应，通过体外细胞实验及小鼠实验验证其抗肿瘤功效，并通过多种实验方法揭示其中的分子机制，提供抗肿瘤治疗新疗法，助力临床ici治疗价值最大化。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一目的，本发明提供了一种长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10，所述长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10于2022年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.25777，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

4、所述长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10的16s rdna的核苷酸序列如seq id no:1所示。本发明的长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10的16s rdna与已知长双歧杆菌菌株对比(national center for biotechnology数据库)至少存在三个碱基突变位点，其亲缘关系最近的菌株为bifidobacterium longum subsp.suillum strainsu 851。

5、本发明收集了对pd-1抑制剂治疗有响应的肿瘤患者的粪便样本，通过在不同条件下培养成功分离并鉴定出一株长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10。

6、通过溶血试验、耐药性试验等证明分离出的长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)sysu10具有较好的安全性及益生菌特性。

7、通过肠道定植能力检测、耐酸耐胆盐测试与肠粘附性实验证明长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10具有良好的产业化潜力。

8、第二目的，本发明提供了一种制剂，所述制剂包括含有上述的长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10的菌悬液。

9、优选地，所述制剂通过口服、尾静脉注射、瘤内注射或癌旁注射等方式给药。本发明含有的长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10的制剂能够在肿瘤部位富集，发挥抗肿瘤疗效(抑制肿瘤生长与转移)，改善患者的生活质量。

10、优选地，所述制剂还包括药学上可接受的载体和辅料，所述制剂的剂型包括冻干粉，片剂、胶囊剂、颗粒剂或针剂中的至少一种。所述制剂可以制备成食品、饮料、食品补充剂、益生菌或保健食品。

11、优选地，所述制剂包括含有上述的长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10活菌、细菌衍生物或者细菌代谢物中的至少一种组合的菌悬液。

12、第三目的，本发明提供了上述长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10在制备抗肿瘤制剂或药物中的应用。

13、第四目的，本发明提供了上述长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10、或其衍生物、或其代谢物联合免疫检查点抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

14、本发明将长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10联合免疫检查点抑制剂可以更好地抑制肿瘤的生长。本发明通过抑制肿瘤的生长或减少肿瘤的转移灶来测量增强的治疗效果。

15、将长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10、或其衍生物、或其代谢物联合免疫检查点抑制剂构成组合物，其中长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10、或其衍生物、或其代谢物可以促进免疫检查点抑制剂的抗肿瘤疗效，抑制肿瘤生长与转移。

16、优选地，所述肿瘤肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌、胆管癌、结肠癌、结直肠癌、弥漫性大b细胞淋巴瘤、多形成性胶质细胞瘤、胶质瘤、头颈癌、肾嫌色细胞癌、混合肾癌、肾癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、肝癌、肺腺癌、肺鳞癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、前列腺癌、直肠腺癌、肉瘤、皮肤黑色素瘤、胃癌、食管癌、睾丸癌、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤和软组织肉瘤中的一种或几种。上述肿瘤的种类不仅仅为上述内容，还包括了恶性肿瘤、转移性肿瘤或非转移性肿瘤等本领域常规的肿瘤种类。

17、在本发明的一个具体的实施例中，肿瘤为结直肠癌。

18、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述免疫检查点抑制剂为作用于t细胞负性共刺激/共抑制分子和/或其配体的阻断剂的一种或多种的组合；所述配体选自ctla-4、pd-1、pd-l1、pd-l2、b7-1、b7-2、b7-h3、b7-h4、b7-h6、a2ar、ido、tim-3、btla、vista、tigit、lag-3、cd40、kir、ceacam1、garp、ps、csf1r、cd94/nkg2a、tdo、tnfr、dcr3中的一种。优选地，所述免疫检查点抑制剂包括pd-1单克隆抗体。

19、第五目的，本发明提供了上述长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10在制备纳米载药系统中的应用。

20、第六目的，本发明提供了一种纳米递药系统，将上述长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10负载纳米颗粒形成纳米递药系统。

21、本发明利用长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10厌氧趋向的特点将其与功能性纳米颗粒结合构成纳米递药系统，提供了高特异性的肿瘤治疗方案。

22、作为本发明所述纳米递药系统的优选实施方式，所述纳米颗粒包括l-岩藻糖白蛋白。

23、作为本发明所述纳米递药系统的优选实施方式，所述纳米递药系统通过尾静脉进行注射。通过尾静脉注射上述纳米递药系统可以提高抗肿瘤的治疗效果。

24、本发明提供的纳米递药系统，可以明显改善毒副作用大、易转移复发、持续时间短、生存期短、和生活质量差等常规疗法的缺点；针对免疫检查点单药疗法的缺点：作用瘤种范围有限和药物响应人群少，有明显的改善；针对免疫检查点联合放化疗疗法的缺点：毒副作用大和药物响应人群少，有明显的改善。

25、本发明给出的治疗方法针对以下患者都有很好的治疗效果：治疗不可手术，无可用靶向药物，放疗，化疗等无效的肿瘤患者；治疗单药免疫检查点抑制剂无效或耐药(原发性、适应性和获得性耐药)的肿瘤患者；治疗免疫检查点抑制剂联合放疗、化疗、靶向治疗无效或耐药(原发性、适应性和获得性耐药)的肿瘤患者。

26、第七目的，本发明提供了一种上述纳米递药系统的制备方法，包括以下步骤：

27、s1、将上述长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10的菌液接种于培养基，12h后达到对数生长期，取长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10使用；

28、s2、通过单轴静电喷雾工艺制备包裹有l-岩藻糖白蛋白的纳米颗粒；

29、s3、将s1所收集的长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10与步骤s2所制得的纳米颗粒混合，再加入edc和nhs，然后在37℃的厌氧环境中震荡孵育；洗涤离心，收集下层沉淀，即得纳米递药系统。

30、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

31、本发明通过使用长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10联合免疫检查点抑制剂(pd-1单克隆抗体)对植瘤小鼠进行抗肿瘤治疗，本发明筛选的长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10可以刺激产生的抗肿瘤免疫保护反应，重塑肿瘤微环境，使“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤。并且，长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10显著增强免疫检查点抑制剂对结直肠癌的治疗效果，不仅能够抑制肿瘤原位生长同时能够抑制肿瘤细胞的转移且安全性良好。同时本发明还提供了一种长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)sysu10与抗肿瘤活性小分子的l-岩藻糖联用构成纳米载药系统的形式，利用长双歧杆菌(bifidobacterium longum)sysu10厌氧趋向的特点将与功能性纳米颗粒结合，提供了高特异性的肿瘤靶向治疗方案。