Rab11蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物，具体涉及rab11蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用。

背景技术：

1、抗体是一种主要由浆细胞分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等外来物的蛋白质，该外来物被称为抗原。抗体和抗原的结合完全依靠非共价键的相互作用，这种特异性的结合机制使得抗体可以捕获外来微生物以及受感染的细胞，进一步诱导其他免疫机制对其进行攻击，或直接中和其目标。抗体及抗体相关产品已经被广泛应用于生命科学与医学等研究领域，基于抗原-抗体特异性结合而衍生的诸多实验技术奠定了科学研究与临床治疗的重要基础，例如免疫诊断、免疫印迹、酶联免疫吸附、流式细胞分析等等。

2、rab11(ras-related protein 11)是ras超家族的成员，是细胞内膜运输的关键调节剂，参与从运输囊泡的形成到它们与膜的融合。rab家族蛋白质成员在非活性gdp结合形式和活性gtp结合形式之间循环，能够将不同组的下游效应子募集到膜上，直接负责囊泡的形成、运动、束缚和融合。rab11主要参与调节细胞内吞循环，同时在胞质分裂过程中作为膜传递的主要调节剂。rab11还与rab8等多种蛋白质一起参与上皮细胞极化、促进细胞的转胞吞作用，同时参与多种重要细胞膜蛋白从高尔基体至细胞膜的转运和分选。

3、在研究rab11过程中，抗体是一个非常重要的研究工具，对于患者诊断、病毒分析与研究等都具有重大的价值和意义。然而，传统的鼠、兔等动物仅能识别抗原表面平展的多肽。因此，需要开发一种能够识别抗原表面复杂的空间结构，产生高度特异性、高亲和力的纳米抗体。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本发明提供了一种rab11蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用。

2、第一方面，本发明提供用rab11蛋白免疫骆驼科动物所得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。

3、在一些实施方案中，所述骆驼科动物选自单峰驼、双峰驼、美洲驼、骆马、羊驼和小羊驼，优选为羊驼。

4、在一些实施方案中，所述抗体为纳米抗体，所述抗体活性片段为纳米抗体活性片段。

5、在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体。

6、在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段与所述rab11蛋白结合的kd值在500nm以下，优选在300nm以下，更优选在200nm以下，更优选在100nm以下，更优选在50nm以下。

7、在一些实施方案中，所述rab11蛋白具有如seq id no:1所示的氨基酸序列。进一步优选地，所述rab11蛋白由包括如下步骤的方法制备而成：将编码所述rab11蛋白的核苷酸序列构建至载体质粒；将所述载体质粒转染至真核细胞系中表达，纯化。

8、在一些实施方案中，所述rab11蛋白可通过商业渠道获得。

9、第二方面，本发明提供一种构建抗体文库的方法，所述方法包括如下步骤：

10、(1)将rab11蛋白作为抗原免疫骆驼科动物，采集被免疫动物的静脉外周血，分离得到淋巴细胞；

11、(2)提取所述淋巴细胞的总mrna，反转录为cdna并进行扩增；

12、(3)将所述扩增得到的dna插入病毒表达载体，转化入细菌，收集菌落，得抗体文库。

13、在一些实施方案中，所述骆驼科动物选自单峰驼、双峰驼、美洲驼、骆马、羊驼和小羊驼，优选为羊驼。

14、在一些实施方案中，步骤(1)所述免疫采用皮下注射方式。所述免疫的次数优选为3～5次。所述静脉外周血优选在最后一次免疫之前和之后分别采集。

15、在一些实施方案中，步骤(3)所述病毒表达载体为噬菌体表达载体。

16、在一些实施方案中，步骤(3)所述细菌为tg1感受态细菌。

17、第三方面，本发明提供上述构建抗体文库的方法获得的抗体文库，或由所述抗体文库表达产生的多克隆抗体。

18、第四方面，本发明提供一种构建抗原特异性抗体文库的方法，所述方法包括如下步骤：对第三方面所述的抗体文库进行筛选，获得抗原特异性抗体文库。

19、在一些实施方案中，所述构建抗原特异性抗体文库的方法包括如下步骤：

20、(i)对所述抗体文库进行培养，释放病毒；

21、(ii)将所述病毒与抗原进行孵育，去掉与抗原非特异性结合的病毒，保留与抗原特异性结合的病毒；

22、(iii)用所述与抗原特异性结合的病毒侵染细菌，收集菌落，获得抗原特异性抗体文库。

23、在一些实施方案中，步骤(iii)所述细菌为大肠杆菌。

24、第五方面，本发明提供上述构建抗原特异性抗体文库的方法获得的抗原特异性抗体文库，或由所述抗原特异性抗体文库表达产生的与抗原特异性结合的多克隆抗体。

25、第六方面，本发明提供一种制备抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法，所述方法包括如下步骤：对第三方面所述的抗体文库进行筛选，获得与抗原特异性结合的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。

26、在一些实施方案中，所述制备抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法包括如下步骤：

27、(a)对所述抗体文库进行培养，释放病毒；

28、(b)将所述病毒与抗原进行孵育，去掉与抗原非特异性结合的病毒，保留与抗原特异性结合的病毒；

29、(c)用所述与抗原特异性结合的病毒侵染细菌，将被侵染的细菌涂抹至平板培养基培养，挑选单一菌落。

30、在一些实施方案中，步骤(c)所述细菌为大肠杆菌。

31、在一些实施方案中，可以对所述单一菌落进行扩大培养，之后进行抗原特异性结合鉴定。

32、在一些实施方案中，可以对所述单一菌落进行扩大培养，然后进行步骤(d)：提取dna，转化至宿主细胞并表达，以获得单克隆抗体。

33、第七方面，本发明提供采用上述制备抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法获得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。

34、第八方面，本发明提供特异性识别和/或结合rab11蛋白的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段；所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段包含至少一个重链可变区；所述重链可变区具有：

35、如seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6所示的cdr1；

36、如seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10或seq id no:11所示的cdr2；和

37、如seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15或seq id no:16所示的cdr3；

38、在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如seq id no:2所示的cdr1、如seq idno:7所示的cdr2和如seq id no:12所示的cdr3。

39、在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如seq id no:3所示的cdr1、如seq idno:8所示的cdr2和如seq id no:13所示的cdr3。

40、在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如seq id no:4所示的cdr1、如seq idno:9所示的cdr2和如seq id no:14所示的cdr3。

41、在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如seq id no:5所示的cdr1、如seq idno:10所示的cdr2和如seq id no:15所示的cdr3。

42、在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如seq id no:6所示的cdr1、如seq idno:11所示的cdr2和如seq id no:16所示的cdr3。

43、在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如seq id no:17所示的氨基酸序列，或seq id no:17所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。

44、在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如seq id no:18所示的氨基酸序列，或seq id no:18所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。

45、在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如seq id no:19所示的氨基酸序列，或seq id no:19所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。

46、在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如seq id no:20所示的氨基酸序列，或seq id no:20所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。

47、在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如seq id no:21所示的氨基酸序列，或seq id no:21所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。

48、在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段包含一个所述重链可变区且缺失轻链。

49、在一些实施方案中，所述抗体为纳米抗体，所述抗体活性片段为纳米抗体活性片段。

50、第九方面，本发明提供编码seq id no:2～seq id no:21任意一条序列所示氨基酸序列或上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列。

51、在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列如seq id no:22所示。

52、在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列如seq id no:23所示。

53、在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列如seq id no:24所示。

54、在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列如seq id no:25所示。

55、在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列如seq id no:26所示。

56、第十方面，本发明提供含有上文所述核苷酸序列的表达载体。

57、在一些实施方案中，所述表达载体为噬菌体表达载体，优选为噬菌体表面展示筛选载体。

58、在一些实施方案中，所述表达载体中还含有编码噬菌体包膜蛋白piii的核苷酸序列。

59、第十一方面，本发明提供外源转入了上文所述表达载体的病毒。

60、在一些实施方案中，所述病毒为噬菌体。

61、第十二方面，本发明提供外源转入了上文所述表达载体的宿主细胞，或者被上文所述病毒侵染的宿主细胞。

62、在一些实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

63、第十三方面，本发明提供利用上文所述宿主细胞表达抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法。

64、第十四方面，本发明提供利用上文所述宿主细胞表达获得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。

65、第十五方面，本发明提供所述上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段经人源化后获得的人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。

66、第十六方面，本发明提供一种蛋白偶联物，其包含上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段或者上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段以及配体。

67、在一些实施方案中，所述配体选自放射性同位素、荧光基团和递送载体。

68、第十七方面，本发明提供检测样品中rab11蛋白含量的试剂盒，其包含上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段或者上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。

69、在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段经标记物标记。优选地，所述标记物选自酶、化学发光基团和同位素基团。

70、在一些实施方案中，所述样品为动物血清，优选为人血清。

71、第十八方面，本发明提供上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述蛋白偶联物或者上文所述试剂盒在检测样品中rab11蛋白含量中的应用。

72、在一些实施方案中，所述样品为动物血清，优选为人血清。

73、第十九方面，本发明提供利用上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述蛋白偶联物或者上文所述试剂盒检测样品中rab11蛋白含量的方法。

74、在一些实施方案中，所述样品为动物血清，优选为人血清。

75、与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下显著优势：本发明提供的抗体可用于检测血清中目标抗原的含量，进一步用于检测原癌基因，判断病变，有潜在临床诊断和治疗价值；本发明提供的抗体结构简单，容易进行基因工程改造，具有成熟的优化策略用于增强纳米抗体亲和力、延长体内半衰期以及与其它分子偶联用于药物开发，如连接放射性同位素，偶联传递药物、cart和荧光标记高分辨成像等；本发明提供的抗体序列与人igg的vh区域序列同源性高，少数氨基酸突变即可以实现单域抗体的人源化；且本发明提供的抗体稳定性高，能避免常规抗体需要低温储存和运输的要求，有利于大规模普及应用，量产成本较低，易于大规模重组制备。本发明所设计的单克隆纳米抗体在成本低廉的大肠杆菌表达系统就可以很好的重组表达，量产成本低、产量可以高达数十毫克/升大肠杆菌。大肠杆菌重组表达系统技术成熟，质量控制简单，有利于降低生产成本、实现规模化生产。

76、不同于传统技术依赖于鼠、兔、猴、羊等经典的模式动物，本发明的技术方案是依靠羊驼的免疫系统产生的抗体，被成为“纳米抗体”。纳米抗体是从骆驼、鲨鱼等动物体内免疫球蛋白分离出的微小抗体片段，它具有与完整抗体相同的抗原结合能力和结构稳定性，是现有可结合目标抗原的最小的单位，相对分子质量仅为15kd。相比于传统的鼠、兔等动物仅能识别抗原表面平展的多肽，羊驼等动物体内的免疫系统能够识别抗原表面复杂的空间结构，能够产生高度特异性、高亲和力的纳米抗体。