一种鸡GATA2基因启动子及其构建方法和应用

本发明涉及基因工程，特别是涉及一种鸡gata2基因启动子及其构建方法和应用。

背景技术：

1、gata结合蛋白(gatas)是一类具有2个保守的c-x2-c-x17-c-x2-c(c为半胱氨酸，x为任意氨基酸)锌指结构的转录因子，能够识别并结合靶基因(t/a)gata(a/g)核苷酸序列发挥调控作用。动物体内gatas共有6个成员，分为2个亚家族；亚家族1包括gata1、gata2和gata3，主要调控中胚层和外胚层衍生组织的分化，在血细胞生成和神经系统发育中发挥重要作用；亚家族2包括gata4、gata5和gata6，参与调控内皮和中胚层衍生组织的发育，对心血管系统、消化系统和泌尿生殖系统的形成具有重要调控作用。

2、gata2是一种参与干细胞维持的转录因子，在造血发育中发挥关键作用。gata2突变与人类多种遗传性和获得性免疫疾病相关，包括骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病等。gata2缺乏综合征(g2ds)是一种发病年龄跨越人生命的各个时期罕见的常染色体显性遗传疾病，最为常见的症状为髓系恶性肿瘤和免疫缺陷。

3、除了在造血系统中的作用外，维持gata2表达被认为是kras驱动的非小细胞肺癌的一个必要条件；临床前模型表明在kras驱动的非小细胞肺癌中，靶向gata2介导的途径具有治疗价值。

4、此外，针对脂肪组织形成的研究显示，gata2对小鼠脂肪组织形成具有重要调控作用。遗传型肥胖症小鼠白色脂肪组织gata2表达水平较正常小鼠明显下调。gata2在小鼠白色脂肪组织高水平表达，过表达gata2抑制小鼠白色脂肪细胞的分化。小鼠棕色脂肪组织也表达gata2，过表达gata2抑制棕色脂肪细胞分化。小鼠为模型的研究显示，gata2至少可通过抑制pparγ2表达、以及与c/ebpα和c/ebpβ发生蛋白互作2种途径抑制脂肪细胞分化。靶向gata2表达可能对于肥胖和代谢疾病的治疗也具有一定的价值。

5、鸡是人类饲养最普遍的家禽，具有重要的经济价值。经过育种工作者近百年的不懈努力，目前商品代肉仔鸡的日增重和饲料转化率都达到了很高的水平。但是，由于在长期育种过程中对生长性状过度选择，现在的商品代肉仔鸡出现了腹部脂肪蓄积过多的问题。腹部脂肪过多蓄积不仅浪费饲料影响肉鸡生产效率，而且引发肉鸡猝死。培育优质低脂肉鸡是控制肉鸡腹部脂肪过多蓄积的有效手段。本课题组的前期研究结果显示gata2在肉鸡腹部脂肪组织和肝脏中具有表达；可能调控鸡腹部脂肪组织形成，体外细胞水平的研究显示过表达gata2对鸡前脂肪细胞的增殖没有明显影响，但是显著抑制鸡前脂肪细胞分化。调控gata2基因的表达水平可能是控制肉鸡腹部脂肪形成的潜在手段。可见，gata2是多种人类疾病发生的调控基因和低脂肉鸡育种的候选基因。但是，对于鸡gata2的具体转录调控机制还不清楚，并且也没有鸡gata2基因的启动子相关报道，因此，确定驱动鸡gata2基因转录的启动子，对于揭示鸡gata2的转录调控机制、培育低腹脂肉鸡、以及揭示一些人类疾病发生的分子机制和开发靶向gata2表达的药物具有潜在应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供种鸡gata2基因启动子及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明公开了9种鸡gata2基因启动子，其在鸡前脂肪细胞中都具有启动子活性，且受到特定转录因子klf2的调控，这为揭示鸡gata2的转录调控机制、培育低腹脂肉鸡以及揭示一些人类疾病发生的分子机制和开发靶向gata2表达的药物具有潜在应用价值。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种鸡gata2基因启动子，所述鸡gata2基因启动子核苷酸序列选自如seq id no：1-seq id no：9所示任一条序列。

4、优选的是，所述鸡gata2基因启动子在鸡前脂肪细胞中表现启动子活性。

5、优选的是，在所述鸡前脂肪细胞中klf2调控鸡gata2基因启动子的活性。

6、本发明还提供一种引物对，所述引物对用于扩增所述的鸡gata2基因启动子，所述引物对由如seq id no：10-14所示任一条序列作为上游引物，以及seq id no：15所示序列作为下游引物组成。

7、本发明还提供一种重组载体，包括所述的鸡gata2基因启动子。

8、本发明还提供一种重组菌，包括所述的重组载体。

9、本发明还提供一种试剂盒，包括用于扩增所述的鸡gata2基因启动子a1-a5的引物对，所述引物对是由如seq id no：10-14所示任一条序列作为上游引物，以及seq id no：15所示序列作为下游引物组成。

10、本发明还提供所述的鸡gata2基因启动子的应用，所述应用包括如下任一项：

11、(1)在靶向鸡gata2基因表达的遗传育种中的应用；

12、(2)在制备调控鸡前脂肪细胞中内源性gata2蛋白表达的饲料添加物和药物中的应用。

13、本发明还提供一种所述的鸡gata2基因启动子的构建方法，其特征在于，包括利用引物对扩增所述鸡gata2基因启动子的步骤，所述引物对是由如seq id no：10-14所示任意一条序列作为上游引物，以及seq id no：15所示序列作为下游引物组成扩增鸡gata2启动子a1-a5，使用化学合成方法获得鸡gata2启动子a6-a9。

14、本发明公开了以下技术效果：

15、本发明公开的鸡gata2基因启动子，是以鸡全血中提取dna作为模板，利用引物进行pcr扩增获取了5个鸡gata2启动子a1-a5序列(seq id no：1-seq id no：5)和利用化学合成的4个鸡gata2启动子a6-a9(seq id no：6-seq id no：9)，利用重组技术将其构建到pgl4.10载体，获得9种含有不同长度鸡gata2启动子序列(a1-a9)的荧光素酶报告基因质粒。

16、通过试验验证，发现9种gata2启动子在鸡前脂肪细胞中都具有启动子活性，说明这些启动子都能直接调控鸡gata2转录表达，过表达klf2促进本发明公开的多种鸡gata2启动子活性，敲低klf2抑制本发明公开的多种鸡gata2启动子活性。western blot分析显示在鸡前脂肪细胞中过表达klf2促进gata2的内源性表达，敲低klf2抑制gata2的内源性表达；染色质免疫共沉淀(chip)-pcr显示klf2可以在鸡前脂肪细胞中结合gata2启动子(-1570/-1410)和(-216/-15)区间的序列，表明klf2可以调控鸡前脂肪细胞中内源性gata2的表达，这与本发明公开的klf2调控鸡gata2启动子报告基因结果一致，表明本发明公开的鸡gata2启动子可以在体外细胞水平预示gata2的转录活性。因此，本发明对于揭示鸡gata2的转录调控机制、培育低腹脂肉鸡以及揭示多种人类疾病发生背后的分子机制和开发靶向gata2表达的药物具有潜在应用价值。