一种人工核酸分子及其制备方法和应用与流程

本技术属于生物医药工程领域，特别涉及一种人工核酸分子及其制备方法和应用。

背景技术：

1、mrna翻译合成蛋白的过程十分复杂，并且受到多种因素调控。研究表明，mrna的5’和3’utr与转录后调控密切相关，可对包括mrna转运、降解、亚细胞定位以及翻译效率在内的许多方面产生影响。其中，3’utr主要参与mrna转录过程的调节，而5’utr主要参与目的蛋白翻译过程的调节，对转录后mrna的稳定、折叠及核糖体识别和结合等阶段产生影响。5’utr含有内部核糖体进入位点(ires)，因此具有介导内部翻译起始的功能。高度结构化的5’utr对mrna翻译起始的调控主要有三种途径：(1)通过本身高度复杂的二级结构在空间上阻碍翻译起始；(2)通过上游元件来抑制翻译起始；(3)通过内部核糖体进入位点(ires)元件的“非帽依赖”起始途径来抑制翻译起始。

2、现有研究表明，5’utr的结构可以影响mrna的稳定性，进而影响基因表达的效率。真核生物5’utr的5’端具有一个帽子结构，是真核核糖体识别mrna的结构信号，帽类似物(如m7gmp和m7gdp等)会强烈抑制带帽mrna的翻译。5’utr的序列、长度、二级结构(例如茎环结构)以及与某些结合蛋白的相互作用还可以对mrna的半衰期产生影响，进而实现对mrna的稳定性进行调控。

3、目前，核酸类药物研发的主要难点在于其体外表达中的稳定性和规模化水平，因此，如何借助其自身结构而非外部生产调节来实现这一目的，成为本领域技术人员急需解决的技术问题。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种人工核酸分子，以及该人工分子的制备方法和其在制备生物制品(特别是疫苗)中的应用。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明一方面提供了一种人工核酸分子，包括5’端调控序列以及连接在所述5’端调控序列下游的至少一个开放阅读框；

4、所述开放阅读框编码病毒免疫原性蛋白，例如，病毒表面糖蛋白、结构蛋白等；

5、所述5’端调控序列包含一个5’utr元件，所述5’utr元件源自哺乳动物功能蛋白基因，并且其中uorf片段被部分或完全去除；所述功能蛋白为与肝脏功能相关的球状蛋白。

6、发明人通过研究发现，本技术提供的特定的5’端非翻译区结构可以对转录过程进行有效调控，从而促进目的蛋白(病毒抗原蛋白)高效、稳定地表达。

7、进一步地，所述哺乳动物为人，所述球状蛋白具有催化功能(作为酶催化机体内生化反应)、运输功能(在机体内进行物质转移和运输)、贮存功能(在必须时为生物体提供c、h、o、n、s、fe等元素)、防御功能(通过免疫反应抵抗外源异种蛋白对生物体的干扰)以及保护功能(维持机体和组织功能状态稳定)中的至少一种，例如珠蛋白(例如α-珠蛋白或β-珠蛋白)、辅酶(例如还原型辅酶叶绿醇)、白蛋白、补体或细胞色素代谢酶等，优选为人白蛋白、补体或细胞色素氧化酶。

8、研究发现，采用上述基因的5’非编码区片段作为本技术中的调控元件，相比于其他种类的5’非编码区(特别是原核生物基因)可以更有效地实现目的蛋白表达的调控。

9、进一步地，所述5’utr元件选自人白蛋白基因、补体基因或细胞色素氧化酶基因中任一种的5’utr或其同源物、片段或变体。

10、进一步地，所述5’utr元件序列来自seq id no.31～33中任一项所述的序列(依次来自人白蛋白基因、补体基因或细胞色素氧化酶基因)。

11、在另一些实施方式中，所述5’utr元件可以来自moderna的mrna-1273(genbank:mz362876.1)，其序列如seq id no.47所示，或者pfizer的5’utr序列(wo2017059902a1)，其序列如seq id no.48所示。

12、进一步地，所述5’端调控序列还包括连接在所述5’utr元件下游的kozak序列。

13、进一步地，所述人工核酸分子还包括连接在所述开放阅读框下游的3’端调控序列，所述3’端调控序列包含从5’端到3’端依次连接的3’utr元件和poly(a)尾顺式作用元件。

14、进一步地，所述3’端调控序列包含一个3’utr元件和至少一组poly(a)尾顺式作用元件；所述3’utr元件与所述poly(a)顺式作用元件均源自哺乳动物功能蛋白基因，包括poly(a)信号和poly(a)位点，优选地还包括下游作用元件；当具有多组所述poly(a)尾顺式作用元件时，任意两组所述poly(a)尾顺式作用元件具有相同序列的poly(a)尾信号和不同序列的poly(a)位点，优选地还具有不同序列的下游作用单元

15、在一些优选的实施方式中，所述3’utr元件为人白蛋白基因3’utr或其同源物、片段或变体，所述poly(a)尾顺式作用元件为人白蛋白基因中至少一组poly(a)尾顺式作用元件或其同源物、片段或变体。

16、研究发现，采用上述基因的3’非编码区片段作为本技术中的调控元件，相比于其他种类的3’非编码区可以更有效地实现目的蛋白表达的调控。

17、进一步地，所述poly(a)尾顺式作用元件为1组、2组或3组。

18、在一些具体的实施方式中，poly(a)尾顺式作用元件仅有1组，即在3’utr下游依次连接有第一poly(a)信号和第一poly(a)位点(例如seq id no.34所示的序列，其中第1～165位为3’utr元件，166～171位为第一poly(a)信号，172～188位为第一poly(a)位点)。

19、在一些具体的实施方式中，poly(a)尾顺式作用元件仅有1组，即在3’utr下游依次连接有第一poly(a)信号、第一poly(a)位点和第一下游作用元件。

20、在一些具体的实施方式中，poly(a)尾顺式作用元件有2组，即在3’utr下游依次连接有第一poly(a)信号、第一poly(a)位点、第一下游作用元件、第二poly(a)信号和第二poly(a)位点(例如seq id no.35所示的序列，其中第1～165位为3’utr元件，166～171位为第一poly(a)信号，172～188位为第一poly(a)位点，189～320位为第一下游作用元件，321～326位为第二poly(a)信号，327～344位为第二poly(a)位点)。

21、在一些具体的实施方式中，poly(a)尾顺式作用元件有2组，即在3’utr下游依次连接有第一poly(a)信号、第一poly(a)位点、第一下游作用元件、第二poly(a)信号、第二poly(a)位点和第二下游作用元件。

22、在一些具体的实施方式中，poly(a)尾顺式作用元件有3组，即在3’utr下游依次连接有第一poly(a)信号、第一poly(a)位点、第一下游作用元件、第二poly(a)信号、第二poly(a)位点、第二下游作用元件、第三poly(a)信号和第三poly(a)位点(例如seq id no.36所示的序列，其中第1～165位为3’utr元件，166～171位为第一poly(a)信号，172～188位为第一poly(a)位点，189～320位为第一下游作用元件，321～326位为第二poly(a)信号，327～344位为第二poly(a)位点，345～395位为第二下游作用元件，396～401位为第三poly(a)信号，402～414位为第三poly(a)位点)。

23、在一些具体的实施方式中，poly(a)尾顺式作用元件有3组，即在3’utr下游依次连接有第一poly(a)信号、第一poly(a)位点、第一下游作用元件、第二poly(a)信号、第二poly(a)位点、第二下游作用元件、第三poly(a)信号、第三poly(a)位点和第三下游作用元件。

24、进一步地，该人工核酸分子还包括连接在所述poly(a)尾顺式作用元件下游的poly(a)序列。

25、进一步地，所述poly(a)序列的长度为60～120nt，优选为80nt。

26、研究发现，在本技术提供的序列的基础之上直接在下游连接一个poly(a)序列，可以减少mrna的降解、促进mrna的稳定表达，其中以60～120nt为宜，较为优选的方案是80t。

27、进一步地，该人工核酸分子还包括位于所述5’端调控序列上游的上游酶切位点、位于所述poly(a)尾顺式作用元件下游的线性化酶切位点、以及位于所述3’端调控序列下游的下游酶切位点。

28、在一些具体的实施例中，该人工核酸分子(mrna)从5’端到3’端包括5’utr、开放阅读框、3’utr以及poly(a)尾，其中5’utr序列选自seq id no.31～33中任一项所示的序列。在另一些实施方式中，5’utr序列可以选自seq id no.47或48所示的序列。

29、在一些具体的实施例中，该人工核酸分子从5’端到3’端包括5’utr、开放阅读框、3’utr以及poly(a)尾，其中5’utr序列选自seq id no.31～33中任一项所示的序列；3’utr选自seq id no.34～36中任一项所示的序列。在一个优选的实施例中3’utr选自seq idno.35。在另一些实施方式中，5’utr序列可以选自seq id no.47或48所示的序列。在另一些实施方式中，3’utr可以采用moderna的mrna-1273或pfizer的3’utr序列(wo2017059902a1)，其序列如seq id no.49或50所示。

30、在一些具体的实施例中，该人工核酸分子还包括5’帽结构，例如7-甲基鸟苷)。该帽可以增强rna的体内翻译。

31、在一些具体的实施例中，该人工核酸分子中开放阅读框编码能够在受试者中引发免疫反应的多肽抗原，例如能够产生中和抗体的抗原特异性b细胞反应、或/和引发抗原特异性t细胞反应，编码的抗原包含不同长度的氨基酸残基，例如：至少约50、至少约100、或至少约200、或至少约400、或至少约800、或至少约900、或至少约1000、或至少约2000、多至约3000个氨基酸残基，抗原可以源自病原体,尤其是人类病原体(例如细菌、病毒或寄生虫)，或者可以是癌抗原(例如肿瘤抗原和/或新抗原)。在一个实施例中,抗原源自冠状病毒，特别是源自sars-cov-2，hpv抗原，疱疹病毒(例如hsv和vzv)抗原，流感病毒抗原，巨细胞病毒(cmv)抗原，呼吸道合胞病毒(rsv)抗原等。

32、在一些具体的实施例中，该人工核酸分子mrna中的所有尿嘧啶均具有化学修饰，例如为n1-甲基假尿苷。

33、本发明另一方面提供了一种促进蛋白表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：

34、s1：合成上述人工核酸分子；

35、s2：将所述人工核酸分子连接到表达载体上、导入宿主细胞中进行表达。

36、本发明第三方面提供了上述人工核酸分子在制备生物制品中的应用。

37、在一些具体的实施例中，所述生物制品为疫苗，所述开放阅读框为编码病原体结构蛋白的开放阅读框。

38、在一些具体的实施例中，所述生物制品为功能蛋白，所述开放阅读框为编码功能蛋白的开放阅读框。

39、本发明第四方面提供了一种疫苗，包含上述人工核酸分子以及递送载体，所述人工核酸分子均匀分散并包裹在所述递送载体中。

40、进一步地，所述递送载体为脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒或无机纳米颗粒。

41、在一些具体的实施方式中，人工核酸分子中的开放阅读框编码新冠病毒抗原，具体可以是s蛋白、ntd蛋白、rbd蛋白中的一种或多种，或上述蛋白的同源物、片段或变体，或其中任意组合的多聚体形式，例如三聚体。

42、在一些具体的实施方式中，人工核酸分子中的开放阅读框编码hpv抗原，具体可以是l1或l2蛋白或其组合，或其同源物、片段或变体。

43、在一些具体的实施方式中，人工核酸分子中的开放阅读框编码肠道病毒(包括柯萨奇病毒)抗原，具体可以是vp0蛋白、vp1蛋白、vp2蛋白、vp3蛋白、vp4蛋白中的一种或多种，或上述蛋白的同源物、片段或变体，或其中任意组合的多聚体形式，例如五聚体。

44、在一些具体的实施方式中，人工核酸分子中的开放阅读框编码结核杆菌(tb)抗原，具体可以是pe35蛋白、ppe68蛋白、cfp-10蛋白、rv2627c蛋白、ag85蛋白中的一种或多种，或上述蛋白的同源物、片段或变体。

45、在一些具体的实施方式中，人工核酸分子中的开放阅读框编码疱疹病毒(例如hsv和vzv)抗原，具体可以是ul6、ul18、ul35、ul38、ul19、gb、gc、gd、ge、gg、gh、gi、gj、gk、gl、gm中的一种或多种，或上述蛋白的同源物、片段或变体，或其中任意组合的多聚体形式，如三联体。

46、在一些具体的实施方式中，人工核酸分子中的开放阅读框编码流感病毒抗原，具体可以是ha蛋白或na蛋白或其组合，或上述蛋白的同源物、片段或变体。

47、在一些具体的实施方式中，人工核酸分子中的开放阅读框编码巨细胞病毒(cmv)抗原，具体可以是gb、gh、gl、ul115、ul116、ul128、ul130、ul131a、ul148、pp28、pp65、pp150、mdbp中的一种或多种，或上述蛋白的同源物、片段或变体，或其中任意组合的多聚体形式，如五聚体。

48、在一些具体的实施方式中，人工核酸分子中的开放阅读框编码呼吸道合胞病毒(rsv)抗原，具体可以是f蛋白、g蛋白、m2蛋白、n蛋白中的一种或多种，或上述蛋白的同源物、片段或变体，或其中任意组合的多具体形式，如三聚体。

49、本发明的有益效果如下：

50、本发明提供了一种人工核酸分子，包括5’端调控序列以及开放阅读框，所述调控序列中包含来自哺乳动物功能蛋白的5’utr元件，并且该功能蛋白是哺乳动物中与肝脏功能相关的球状蛋白；上述调控序列在适宜的反应条件下可以有效促进开放阅读框的转录和翻译过程，确保过程的高效性和稳定性，从而提高目的蛋白的表达量，由此实现人工核酸分子的快速复制和目标蛋白产物的规模化表达。该人工核酸分子可以应用于疫苗等生物制品的制备中，从而提供稳定性好、生物活性强的相应产品。