一种促进豆科植物及根瘤生长的GmAS5基因及其应用

本发明属于基因工程。更具体地，涉及一种促进豆科植物及根瘤生长的gmas5基因及其应用。

背景技术：

1、豆科植物能够与根瘤菌共生，形成根瘤。根瘤可以利用土壤中的氮元素，还能将空气中的氮气固定为氨，为豆科作物提供氮源。共生固氮作用不仅供于豆科植株自身的氮营养，同时可以减少农业生产中氮肥的施用，据统计，豆科植株每年通过共生固氮向农业生态系统输送氮元素达1.6千万吨，对发展环境友好型农业，减少氮肥施用以及环境污染具有重要意义。

2、天冬酰胺作为豆科作物中有机氮转运的重要形式，还参与调控豆科植物地下部氮代谢以及根瘤共生固氮的过程。而天冬酰胺的生物合成是由天冬酰胺合成酶(asparaginesynthetase，as)催化的。大量的研究结果表明，天冬酰胺合成酶基因参与调控了植株氮代谢以及根系生长发育过程(osuna et al.,2001；lam et al.,2003；antunes et al.,2008；gaufichon et al.,2013,2017；avila-ospina et al.,2015；ohashi et al.,2015；lou etal.,2018)。如在拟南芥中，鉴定到3个asn家族成员基因，主要参与调控氮的同化、转运和储存，以及种子发育等生物学过程(lam et al.,2003；gaufichon et al.,2013；gaufichonet al.,2017)。osasn1参与调控水稻分蘖的形成和生长的过程，在敲除osasn1的突变体株系中出现了株高、根长以及分蘖数的改变(lou et al.,2019)。另外osasn1还参与调控了种子氮储存的过程，在水稻中超量表达osasn1显著提高了氮胁迫条件下的水稻种子蛋白含量和产量(lee et al.,2020)。而在豆科作物苜蓿中共鉴定出6个as家族基因，利用单细胞测序技术，发现存在两个天冬酰胺合成酶基因在根瘤非侵染细胞中的表达量要显著高于侵染细胞(wang et al.,2022)。

3、大豆(glycine max)是重要的粮油作物，富含碳水化合物和蛋白质，同时能提供丰富的微量元素，以及各类维生素和氨基酸，是健康安全的营养食品。在大豆中，gmas1在根瘤的表达水平与根瘤的固氮酶活性正相关，但其具体调控机制尚待进一步解析(antunes etal.,2008)。而关于大豆天冬酰胺合成酶参与根瘤氮代谢过程，影响根系根瘤发育的研究存在较大空白。在现有技术的前期研究中，利用rna-seq转录组测序技术，分析比较正常磷和低磷处理条件下的大豆根系和根瘤的基因表达谱，有10个天冬酰胺合成相关基因在大豆根系部位受低磷响应，而有9个天冬酰胺合成酶相关基因在大豆根瘤部位低磷显著上调表达(xue et al.,2018)，但并未显示这些天冬酰胺合成酶相关基因参与根瘤氮代谢过程，与根瘤的生长发育相关。因此，对现有的天冬酰胺合成酶相关基因进行系统的功能分析，克服现有植物根瘤氮代谢关键基因天冬酰胺合成酶的研究不足，进一步分析对大豆的生长代谢调控机制，具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明是为了克服现有植物根瘤氮代谢关键基因天冬酰胺合成酶的研究不足，以及植物培育、种植过程中所受到的低磷胁迫的问题；提供一种促进豆科植物及根瘤生长的gmas5基因及其应用。

2、本发明另一目的是提供一种促进大豆生长和/或在磷胁迫下促进大豆生长的方法。

3、本发明又一目的是提供一种构建耐低磷胁迫转基因植物的方法。

4、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

5、本发明研究显示大豆天冬酰胺合成酶基因gmas5是一个在根瘤中受低磷胁迫增强表达的基因，该基因的表达受外源磷浓度的调控，gmas5的cdna核苷酸序列如seq id no.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。本发明研究显示gmas5具有天冬酰胺合成酶活，正调控大豆天冬酰胺的合成。通过大豆离体毛根、下胚轴注射转化以及大豆整株转化实验，结果表明gmas5具体调控根瘤生长发育，提高大豆植株生物量的功能；同时，在低磷胁迫促进gmas5在不同时期根瘤中特别是在成熟的根瘤中的表达；另外，在低磷条件下，超量表达gmas5均能促进大豆及根瘤的生长，增加植株全氮全磷含量。

6、因此，本发明提供如seq id no:1所示正调控大豆天冬酰胺的合成酶基因的如下应用：

7、在促进大豆生长和/或在低磷条件下促进大豆生长中的应用。

8、在制备促进大豆生长和/或在制备低磷条件下促进大豆生长的产品中的应用。

9、促进大豆天冬酰胺合成酶基因gmas5表达的制剂在促进大豆生长和/或在磷胁迫下促进大豆生长中的应用。

10、优选地，所述磷胁迫为低磷胁迫。

11、在促进植株根瘤生长或及增加植株氮磷含量中的应用。

12、在制备转基因植物中的应用。

13、优选地，所述转基因植物是指能够与根瘤菌共生的转基因植物。

14、优选地，所述植物为双子叶植物。

15、更优选地，所述双子叶植物为豆科作物。

16、更优选地，所述豆科作物为大豆。

17、进一步地，上述gmas5基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

18、本发明提供一种促进大豆生长和/或在磷胁迫下促进大豆生长的方法，采用促进大豆天冬酰胺合成酶基因gmas5表达的制剂对大豆进行处理。

19、本发明还提供一种构建耐低磷胁迫转基因植物的方法，利用转基因技术将大豆天冬酰胺合成酶基因gmas5的重组表达载体导入植株中，进而获得转基因植物。

20、优选地，含有gmas5基因的重组表达载体，可采用现有的植物表达载体构建方法得到；将重组表达载体导入植株中可以采用如：农杆菌介导的整株转化法转化到大豆中，或通过例如农杆菌介导的转化法转化到烟草表皮细胞中。

21、更优选地，所述植物表达载体包括双元农杆菌载体等，如ptf101s或其它衍生植物表达载体。

22、优选地，具体为采用含有基因gmas5表达载体的基因工程菌，侵染大豆子叶结，得到大豆体外诱导再生转基因植株。

23、本发明具有以下有益效果：

24、本发明研究显示大豆天冬酰胺合成酶基因gmas5是一个在根瘤中受低磷胁迫增强表达的基因，该基因的表达受外源磷浓度的调控；gmas5具有天冬酰胺合成酶活，正调控大豆天冬酰胺的合成。本发明通过大豆离体毛根、下胚轴注射转化及整株转化实验，结果表明gmas5具有调控根瘤生长发育，提高大豆植株生物量的功能；同时，在低磷胁迫促进gmas5在不同时期根瘤中特别是在成熟的根瘤中的表达；另外，在低磷条件下，超量表达gmas5均能促进大豆及根瘤的生长，增加植株全氮全磷含量；gmas5不仅影响了根瘤氨基酸代谢过程，超量表达促进大豆复合植株生长发育，该基因的功能研究对于解析豆科植物适应低磷的分子机制具有重要意义，还揭示了大豆gmas5基因在根瘤中的功能，并对豆科作物根瘤氮代谢与转运的机制提供更多的见解。