一种快速HLA测序分型组合试剂盒及分析方法与流程

本发明属于生物，更具体地涉及一种快速hla测序分型组合试剂盒及分析方法。

背景技术：

1、人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，hla)系统是机体免疫系统的重要组成部分，在机体的抗原呈递和免疫应答中发挥重要作用。hla基因与人类多种疾病的发生、发展和预后密切相关。人类的i类基因位点命名为hla-a、hla-b、hla-c，分布于所有的组织细胞上，为细胞膜上的移植抗原，是引起移植后排斥反应发生的主要抗原。ⅱ类基因则命名为hla-d，hla-d又分为hla-dr、hla-dq、hla-dp等亚区，主要分布于免疫细胞上，它们可以作为免疫细胞间识别标记而诱发免疫应答和调节免疫细胞间的相互作用，在免疫应答反应中发挥重要作用。ⅲ类基因区位于hla-i、ⅱ类基因区之间，由一些与补体和某些炎症因子编码相关的基因组成。这些基因在机体的免疫及机体对外界环境的适应性方面均有重要作用。准确的hla抗原分型技术无疑在基础研究和临床应用上都有很重要的意义。

2、hla分型主要应用于组织配型、输血配型、疾病相关等位基因检测及遗传进化分析等方面。现有的hla分型技术：1、pcr-ssp方法：借助pcr技术获得hla型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定hla型别，其优点是简单易行,分辨率可从低到高,成本低，但其缺点是不易自动化，不能检测新的等位基因，不能识别非经典的hla基因和假基因；2、pcr-sso方法：主要为onelambda试剂盒检测分型，是针对目前已有的类型进行检测，此方法具有灵敏度、特异性强、需样本量少等优点，但不同探针的杂交条件的须严格统一(如温度，离子强度),易出现误差，不能检测新等位基因，对某些杂合子分辨率也不好；3、pcr-sbt测序分型：通过pcr扩增所要分析的基因片断，然后对dna序列进行分析，可以直接得到基因型，其分辨率高，可大规模进行，精确度高，能直接发现新的等位基因，但是由于杂合子的存在，无法分辨单元型。只能进行局部(外显子)测序而使模棱两可基因分型结果的出现比率较高。对于测序的区域外显子序列一样的类型、以及不同等位基因的组合具有相同结果的测序结果无法正确分型；4、ngs法：ngs法保证了分型结果的准确性和极高的分辨率，但ngs法在样本制备时需要用特殊序列对每个个体进行标识，读取数据后需要进行大量的重复序列拼接处理，需要有强大计算机硬件和软件系统的支持。鉴定时间长约1个月左右，对于临床急需的结果无法满足，且成本较高。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种快速hla测序分型组合试剂盒及分析方法，已解决现有技术存在样本分型准确性欠缺、耗时长、数据利用性低等问题。

2、本发明公开了一种快速hla测序分型组合试剂盒，其包含hla基因pcr扩增试剂盒和测序试剂盒，其中hla基因pcr扩增试剂盒中含有hla基因特异性扩增引物组，引物序列信息如下：

3、seq id no.1和seq id no.2(a)、seq id no.3和seq id no.4(b)、seq id no.5和seq id no.6(c)、seq id no.7和seq id no.8(dpa)、seq id no.9和seq id no.10(dpb)、seq id no.11和seq id no.12(dqa)、seq id no.13和seq id no.14(dqb)、seq id no.15和seq id no.16(dr)、seq id no.17和seq id no.20(dr345-3)、seq id no.18和seq idno.20(dr345-4)、seq id no.19和seq id no.20(dr345-5)。

4、本发明从imgt/hla数据库进行序列收集，建立hla序列的数据库，因基因hla多态性高，比对分析数据难度大，筛选出能涵盖所有的位点引物组合是难度极大的，因此我们对于每一类的hla，分别初步挑选出待优化的hla特异性引物各20对，通过样本测试，对引物进行筛选和反应体系的优化，再次结合hla保守序列分析软件进行分析，筛选出引物找到合适的引物序列和扩增位点，使其能满足：设计区域包括内含子区域，减少扩增的污染；能涵盖多个外显子的区段，达到一次扩增测序能覆盖更广的位点信息；对各类的hla类型均能有效扩增，能得到特异性的扩增条带；非特异性扩增少等优良的特点

5、在一优选实施例中，所述hla基因pcr扩增试剂盒含有pcr扩增反应体系试剂，其含dna聚合酶、反应缓冲液等；

6、在一优选实施例中，所述hla基因pcr扩增试剂盒为直扩pcr扩增试剂盒；

7、在一优选实施例中，所述测序试剂盒为sanger测序试剂盒，其含有测序引物，测序引物序列为：

8、seq id no.1和seq id no.2(a)、seq id no.3和seq id no.4(b)、seq id no.5和seq id no.6(c)、seq id no.7和seq id no.8(dpa)、seq id no.9和seq id no.10(dpb)、seq id no.11和seq id no.12(dqa)、seq id no.13和seq id no.14(dqb)、seq id no.15和seq id no.16(dr)、seq id no.17和seq id no.20(dr345-3)、seq id no.18和seq idno.20(dr345-4)、seq id no.19和seq id no.20(dr345-5)。

9、另外一方面，本发明还提供快速hla测序分型的分析方法，包含下列步骤：

10、s1.采集生物样本；

11、s2.分别采用不同hla基因特异性扩增引物对进行样本pcr扩增；

12、s3.纯化获得各自的不同hla基因特异性扩增产物；

13、s4.纯化的hla基因特异性扩增产物在测序仪上测序，得到序列峰图；

14、s5.序列峰图与hla基因外显子在数据库中的标准序列进行对比，确定hla基因的型别；

15、其中步骤s2中所述hla基因特异性扩增引物组，其扩增引物序列为：

16、seq id no.1和seq id no.2(a)、seq id no.3和seq id no.4(b)、seqid no.5和seq id no.6(c)、seq id no.7和seq id no.8(dpa)、seq id no.9和seq id no.10(dpb)、seq id no.11和seq id no.12(dqa)、seqid no.13和seq id no.14(dqb)、seq id no.15和seq id no.16(dr)、seq id no.17和seq id no.20(dr345-3)、seq id no.18和seq idno.20(dr345-4)、seq id no.19和seq id no.20(dr345-5)。步骤s4中所述3)数据库为国际组织imgt数据库(https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)。

17、在一优选实施例中，所述步骤s1所述生物样品为全血、颊粘膜拭子、活检样本或冷冻组织或包含基因组dna的任何其它样品，优选为血浆；所述步骤s1还含dna提取步骤；

18、在一优选实施例中，所述步骤s2为pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行纯化；

19、在一优选实施例中，所述步骤s5中，对于存在缺失、移位导致套峰结果情况，进行下列步骤：两个亲本之间的碱基序列的不同，包括长度的不同；若存在碱基缺失，移动序列，再跟测序峰图比对，观察测序峰是否一致，再进行常规分析。

20、本领域以前对于测序数据中存在套峰的情况，均舍弃，本发明人通过对大量的数据分析，总结了存在缺失、移位导致套峰出现的情况，可对套峰的数据进行分析，增加了数据的可利用性。

21、本发明试剂盒及方法可在5小时内获得样本的hla不同类型的序列数据，并一次性达到hla分型的最高分辨率，同时还可以通过测序的方式，发现新的等位基因，以及在测序结果方面，相较以前的方法，时间更为快速，更好地了解样本本身的序列情况，从而对型别的判定更加合理和准确。因此，本发明在检测效率、成本控制、数据质量等方面都有质的飞跃。应用这种新技术进行高分辨配型，成本显著降低，且本发明得到的数据更加可靠、真实。且本方法新开发了一种对于套峰分析的方法，增加了数据的可利用性。