利用远交系鼠制备识别弱抗原性半抗原的抗体的方法与流程

本发明涉及免疫学，具体地说，涉及一种基于杂交瘤技术或单b细胞分选技术的识别弱抗原性半抗原的抗体的制备方法。

背景技术：

1、1975年kohler和milstein首先报道用细胞杂交技术使经绵羊红细胞（srbc)免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,建立起第一个b细胞杂交瘤细胞株,并成功地制得抗srbc的单克隆抗体，并因此获得了1984年诺贝尔生理医学奖。常规的鼠杂交瘤技术多使用近交系小鼠和大鼠，如balb/c小鼠，c57bl/6j小鼠，f344大鼠和lou/c 大鼠。近交系小鼠的遗传背景均一，做免疫实验结果一致性好。其中balb/c小鼠由于性格较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，生产性能好，繁殖期长，一般无相互侵袭习性，比较容易群养。一般环境洁净的实验室均能饲养成活，而且许多融合用的骨髓瘤细胞都有balb/c遗传背景，所以目前开展杂交瘤技术的实验室多选用balb/c小鼠。但是近交系鼠由于近交衰退，生活力弱，对饲养环境要求高，产仔少，营养要求高。另外，近交繁殖的动物，往往对弱抗原性小分子半抗原的免疫应答比较弱，如疏水性多肽，脂溶性维生素，脂类激素（包括类固醇激素和脂肪酸衍生物激素）等，同时近交系鼠产生的抗体多样性和亲和力都比较低。随着单抗技术的发展，美国epitomics公司和英国bioventix公司分别开发了兔单克隆抗体和绵羊单克隆抗体技术。兔和绵羊的免疫系统强于鼠类，相对来说容易获得识别弱抗原性半抗原的单抗。但兔单克隆抗体和绵羊单克隆抗体因为价格昂贵及专利的原因，限制了其在科研中的应用。因此，用常规的方法制备识别弱抗原性半抗原的鼠单克隆抗体具有一定的挑战性。

2、远交系又叫封闭群，是指在一定群体内，以非近亲交配方式育成的动物品系，且连续 15 代不从外部引入新的动物种群。遗传背景具有群体均一性，但个体各异，实验能够反映特定群体遗传背景下的情况；繁殖能力强，环境适应能力高。远交系鼠类包括km小鼠，icr小鼠，cf-1小鼠，nmri小鼠，wistar大鼠和sprague-dawley（sd）大鼠等。km小鼠即昆明小鼠，是我国生产量、使用量最大的远交系小鼠，被广泛应用于药理学、毒理学等领域的研究，以及药品、生物制品的生产与检定。km小鼠基因库大，基因杂合率高，抗病力和适应力很强，繁殖率和成活率高。远交系一般都不是由近交繁殖而来，使其非常容易产生高亲和力、多样化程度高的抗体。远交系鼠类似人类，个体之间的遗传差异很大，而近交系鼠好比孪生子。也就是说，近交系鼠对抗原的免疫应答比较一致，即或者都应答，或者都不应答。而远交系鼠个体对抗原的免疫应答完全不同，有些应答很好，有些根本不应答。远交系动物用于制备抗体的最经典案例是新西兰大白兔，目前所有制备抗体用的兔子都是远交系。一般认为兔子抗体的亲和力要高于老鼠，原因除了兔子个体较大，免疫系统更复杂以外，远交系也是一个重要原因。

3、本发明通过探索免疫远交系小鼠和大鼠，成功搭建了远交系小鼠单克隆抗体和远交系大鼠单克隆抗体制备平台。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于远交系鼠的识别弱抗原性半抗原的抗体的制备方法。

2、为了实现本发明目的，本发明提供一种基于远交系鼠免疫、杂交瘤技术或单b细胞分选技术的弱抗原性半抗原的抗体的制备方法，杂交瘤技术制备识别弱抗原性半抗原的抗体包括以下步骤： (1)抗原偶联：根据弱抗原性半抗原的结构，设计免疫原，将半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原；(2)动物免疫：免疫远交系鼠，然后收集免疫后实验动物的血清，测定效价、竞争灵敏度和天然反应；(3a)细胞融合：选取效价和竞争灵敏度高、天然反应优良的免疫动物直接处死，收集全血制备多克隆抗血清。同时分离其脾脏b淋巴细胞，将之与鼠骨髓瘤细胞按照3:1-10:1的比例进行细胞融合；(4a)单克隆筛选：将融合后的细胞转入含hat的半固体培养基中，二氧化碳孵箱培养7-10天后进行特异性单克隆抗体筛选；(5a)抗体纯化：将得到的特异性单克隆细胞打入动物体内收集腹水纯化得到单克隆抗体，或者体外扩大培养收集细胞培养上清纯化得到单克隆抗体。

3、单b细胞分选技术制备识别弱抗原性半抗原的抗体包括以下步骤： (1)抗原偶联：根据弱抗原性半抗原的结构，设计免疫原，将半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原；(2)动物免疫：免疫远交系鼠，然后收集免疫后实验动物的血清，测定效价、竞争灵敏度和天然反应；(3b)单b细胞分选：选取效价和竞争灵敏度高、天然反应优良的免疫动物直接处死。从免疫动物的脾脏或外周血中，使用流式细胞仪分选半抗原特异性的单b细胞；(4b)抗体测序：将分选后的单b细胞在96孔板中扩大培养后裂解，提取rna，做逆转录pcr扩增其抗体可变区基因。利用核苷酸测序确定抗体的可变轻链和重链结构域的编码核酸序列；(5b)细胞转染：将单克隆抗体轻链和重链可变结构域的编码核酸连接到质粒表达载体，并转染宿主细胞；(6b)单克隆筛选：将转染后的宿主细胞进行亚克隆化，得到单克隆细胞；(7b)抗体纯化：将稳定培养的单克隆细胞做扩大培养，从细胞培养上清液中纯化重组单克隆抗体。

4、本发明中，步骤(1)所述“弱抗原性半抗原”包括但不限于疏水性多肽、固醇类激素（如维生素d，皮质激素和性激素）、氨基酸衍生物激素（如甲状腺素）、脂类激素（如前列腺素）、环境毒素、农药兽药等分子量低于10 kda的小分子化合物。除非与免疫原性载体（例如至少30个氨基酸的多肽或大蛋白）偶联成免疫原，否则不引起免疫应答，即抗体的形成。一旦形成抗体，它就可以与半抗原结合。由此产生的抗体可用于许多领域，特别是在免疫诊断试剂盒的开发中。本文所用的术语“多肽”是指氨基酸的聚合物，其具有6个或更多个氨基酸的长度。术语“蛋白质”表示多肽链或具有进一步修饰的多肽链。

5、其中，步骤(1)所述“载体蛋白”为钥孔血蓝蛋白（klh）、牛血清白蛋白(bsa)、卵清蛋白(ova)、甲状腺蛋白(tg)、人血清白蛋白(hsa)、破伤风类毒素、明胶、大豆胰蛋白酶抑制剂等；优选钥孔血蓝蛋白。术语“免疫原”指完全抗原或人工合成抗原。

6、其中，步骤(2)中所述“实验动物”表示非人动物，包括km小鼠，icr小鼠，cf-1小鼠，nmri小鼠，wistar大鼠和sd大鼠。

7、其中，步骤(3a)所述“多克隆抗血清”即多克隆抗体，是一种含有多种类型抗体的抗体混合物，可识别多个抗原表位。其名称中的“多”指抗体混合物由不同类型的浆细胞生产而来。

8、其中，步骤(3a)所述“b淋巴细胞”可来自动物外周血，骨髓和脾脏。

9、其中，步骤(3a)所述“鼠骨髓瘤细胞”为sp2/0-ag14，p3x63ag8.653，p3x63ag8，ns-1，nso，ir983f，y3-ag1.2.3。

10、其中，步骤(3a)所述“细胞融合”为聚乙二醇介导的化学融合和电融合。

11、其中，步骤(4a)所述“抗体”包括各种形式的抗体结构，包括但不限于完整抗体和抗体片段。根据本发明的抗体优选是小鼠、大鼠抗体，嵌合抗体或进一步的基因工程抗体，只要保留根据本发明的特征性质。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选其可变结构域，或至少其抗原结合部位。抗体片段的实例fab、fab '、f(ab ')2和fv片段；单链抗体分子；scfv、sc(fv)2；双抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体，以及单链多肽。本文所用术语“单克隆抗体”是指单一氨基酸组成的抗体分子的制剂，仅识别一个抗原表位，是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体。即除了可能以少量存在的可能突变（例如天然存在的突变）之外，构成群体的个别抗体是相同的。

12、其中，步骤(5a)所述“质粒表达载体”为pcdna和puc57。所述“宿主细胞”为cho细胞，cho k1细胞和hek293细胞等。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：利用远交系鼠，可以大幅度提高血清效价5-10倍，从而得到高亲和力的识别弱抗原性半抗原的抗体。