杆状病毒微滴式数字PCR检测方法及其应用与流程

本发明属于杆状病毒检测，具体涉及杆状病毒微滴式数字pcr检测方法及其应用。

背景技术：

1、杆状病毒是一大类基因组为80～180kb大小、环状dna双链的昆虫病毒。其中研究最多的杆状病毒是作为外源基因表达载体的核型多角体病毒(acmnpv)。该杆状病毒具有较大的柔韧性，可容纳大片段的外源基因插入，是表达外源基因的理想载体。目前该病毒载体常应用于构建昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统。昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统(baculovirus expression vector system,bevs)是一种以杆状病毒作为载体，在昆虫细胞体内表达外源基因的真核表达载体系统。杆状病毒表达载体系统由于具有表达的高效性、安全性等诸多优点而在重组蛋白生产、疫苗的研制以及生物杀虫剂等方面具有很高的应用前景。在bevs大规模表达重组蛋白之前，需要进行大量优化试验以确保最合适的表达条件，所以bevs表达外源蛋白过程中需要对各种工艺参数进行优化，如细胞接种密度、接毒量、感染复数等，其中感染复数(multiplicity of infection，moi)是优化表达的重要的参数之一。感染复数是指具有感染能力的杆状病毒与细胞的比例，而适宜的moi在bevs中能最大程度地表达重组蛋白质，获取最佳收益。moi值＝病毒滴度×病毒体积/细胞个数，为在达到合适的moi时感染细胞，需要测定病毒滴度。病毒滴度即为病毒悬液的浓度，又称病毒的效价，噬菌斑形成单位数或感染中心数。

2、目前，杆状病毒滴度的常用测定方法主要包括蚀斑法和终点稀释法。其中，蚀斑法是指利用病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过不断增殖便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，所以可以通过计数蚀斑数量从而得到病毒滴度。终点稀释法是指将病毒液进行稀释后，接种至动物或培养成单层的细胞，将每个稀释度造成的动物或细胞病变做成曲线，找出造成50％动物或细胞病变的终点稀释度，该点的病毒稀释度即为病毒滴度。然而，这些方法都是利用病毒去感染细胞而间接得到病毒的滴度，且由于不同实验者之间测得的结果相差较大，测量过程繁琐，耗时长，重复效果数据差等缺点，导致得到的数据结果滞后，往往不能及时指导生产。因此，检测病毒滴度的现有方法周期长是该方面目前的主要问题，亟需一种快速、简便、高效的检测方法来解决这一方面的问题。

3、数字pcr是第三代pcr技术，作为一种可以对病毒进行绝对定量的新型检测技术。它的原理主要是采样两种不混相液体，一种为联系相(油)，另一种为分散相(水)，在水油表面张力和剪切的共同作用下，分散相以微小体积单元的形式存在于连续相中，从而形成体积小、样品间不扩散的液滴。在反应过程中，微滴生成器会把反应体系重新进行分配，生成大量、均一的微滴，每个微滴不含或含有一个至数个待检测核酸靶分子，每个微滴可视为一个新的独立反应单元。经pcr扩增后，微滴分析仪将微滴吸入，并使它们依次通过一个双色光学检测系统，并逐个对每个微滴进行检测，含有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例分析得到靶分子的起始拷贝数。相比于蚀斑法和终点稀释法而言，微滴数字pcr法的优势在于检测时间短。比如，有研究建立了微滴式数字pcr法检测猪圆环病毒，时间为4小时到6小时左右；相比于蚀斑法4-5天的检测周期要短很多；且定量结果更精确，在低浓度核酸含量下也能准确和灵敏地进行绝对定量。然而，当前在杆状病毒的检测方面研究较少，且尚未有针对杆状病毒检测的微滴式数字pcr检测技术的报道。因此，有必要针对杆状病毒建立微滴式数字pcr检测方法，以实现杆状病毒的快速检测。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的不足，本发明建立了一种杆状病毒的微滴式数字pcr检测方法，实现了杆状病毒的快速检测，同时为杆状病毒提供一种新的病毒滴度的检测手段。

2、为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

3、本发明第一方面提供了一种杆状病毒微滴式数字pcr检测方法，包括以下步骤：

4、s1、提取含杆状病毒待测样品的核酸；

5、s2、以步骤s1的核酸为模板，利用seq id no:1所示的上游引物，seq id no:2所示的下游引物，seq id no:3所示的探针配制反应体系；

6、s3、将配制好的反应体系加入微滴生成板中，利用微滴生成仪生成微滴；

7、s4、将生成好的微滴进行封膜，封好膜后进行pcr扩增；

8、s5、利用微滴读数仪读取微滴信号，可以收集到荧光信号的为阳性微滴，不能收集到荧光信号的则为阴性微滴。

9、优选地，所述pcr扩增的退火温度为56.0-61.0℃。更优选地，所述pcr扩增的退火温度为58.0℃。

10、优选地，所述上游引物和下游引物的浓度均为400-600nmol/l。更优选地，所述上游引物和下游引物的浓度均为400nmol/l。

11、优选地，所述探针的浓度为200nmol/l。

12、优选地，利用病毒核酸拷贝数对数与病毒滴度之间的线性关系可以获取病毒滴度，线性方程为y＝0.9999x+1.9028，x为病毒滴度(对数)，y为病毒核酸拷贝数(对数)。

13、优选地，杆状病毒核酸的最低检测浓度为3.06copies/μl。

14、本发明根据gp64基因保守序列的特征，设计出引物和taqman探针，建立关于杆状病毒的数字pcr检测方法，并优化退火温度、引物浓度及探针浓度，同时验证该方法的特异性、重复性、灵敏性，并比较其与蚀斑法上的相关性。采用数字pcr和蚀斑法同时检测24份中试生产车间的真实样本，计算两者符合率和相关性，发现该数字pcr法的最适退火温度为58.0℃，最优的引物及探针浓度分别为400nmol/l和200nmol/l。同时，优化的数字pcr法灵敏度低至3.06copies/μl，是普通pcr的100倍，且对其他常见的污染病毒和细菌的特异性测试结果均为阴性。此外，采用数字pcr和蚀斑法同时检测24份中试生产车间的真实样本，两者符合率为84％。可见，本发明成功建立了杆状病毒的数字pcr检测方法，该方法具有良好的特异性及重复性，可用于杆状病毒生产的快速检测及定量分析。

15、优选地，所述pcr扩增的反应程序为：37℃30min；95℃10min；95℃30s，60℃60s，45个循环；98℃10min；最后维持在16℃。

16、优选地，所述封膜为190℃封膜5s。

17、本发明第二方面提供了一种杆状病毒微滴式数字pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括seq id no:1所示的上游引物，seq id no:2所示的下游引物，seq id no:3所示的探针。

18、本发明第三方面提供了第一方面所述的杆状病毒微滴式数字pcr检测方法或第二方面所述的杆状病毒微滴式数字pcr检测试剂盒在杆状病毒定性或/和定量检测中的应用。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

20、目前在国内外企业测定病毒滴度方面上，传统经典方法如蚀斑法和终点稀释法耗时长，效率低，检测周期在5到7天，不利于企业在生产重组蛋白等过程中对病毒滴度的测定与监控。而数字pcr作为新型的病毒滴度的检测技术，其应用前景广阔，但目前尚未有关于杆状病毒的数字pcr检测技术的报道。为此，本发明根据杆状病毒的gp64基因设计引物和探针，并对反应条件和反应程序的优化，同时通过特异性、敏感性和重复性试验对本发明所建立数字pcr方法进行评估，并确定了病毒拷贝数和病毒滴度之间的线性关系，从而建立了一种杆状病毒的微滴式数字pcr检测方法，为杆状病毒的定性或定量检测提供了新的手段。本发明所建立的杆状病毒数字pcr方法稳定，特异性好，灵敏度高，重复性好，能快速实现检测，3-4个小时即可完成，检测后换算成的病毒滴度与经典噬斑法方法测出来的结果基本一致，为实现对杆状病毒检测提供了一种快速简便的技术手段，更好地指导基于该病毒表达系统在生产上的应用。