辣椒疫霉生长发育调控蛋白PcAGO1及其编码基因与应用

本发明属于生物，具体涉及来自辣椒疫霉(phytophthora capsici)的含有argon、paz、mid和piwi结构域的生长发育调控蛋白pcago1及其编码基因与应用。

背景技术：

1、辣椒疫霉(phytophthora capsici)是典型的腐霉科疫霉属植物病原卵菌，在世界范围分布广泛。作为一种重要的土传病原菌，其有着广泛的寄主范围，可侵染包括茄科中的辣椒、烟草以及豆科、葫芦科等26科70多种蔬菜作物。辣椒疫霉在苗期至果期均会引起植株的病害，并导致作物的根茎部、果实的腐烂，严重时导致植株萎蔫甚至猝倒，对作物产量和品质的影响极大，造成严重的经济损失。辣椒疫霉孢子囊产生的游动孢子是再次侵染的重要来源，可经雨水、土壤和气流等途径传播，游动孢子附着在寄主植物表面后会成为休止孢随后萌发产生菌丝以侵染寄主。在田间存在两种交配型时也会发生异宗配合产生卵孢子，卵孢子有抵御逆境的能力，在环境条件合适时其可萌发产生菌丝侵染寄主。

2、在生物体内普遍存在一种由双链rna引发的基因沉默现象称为rna干扰(rnainterference，rnai)，可分为转录水平和转录后水平。具有发卡结构或双链的rna可以被酶剪切加工形成20-30bp的小rna，小rna通过与蛋白argonaute(ago)形成基因沉默复合体进而行使基因沉默功能。rnai对生物的生长发育至关重要，因此形成基因沉默复合体的核心蛋白ago发挥着非常重要的功能。此外，ago蛋白还在植物、病原体的外泌体中被发现，揭示了该蛋白在植物免疫及病原菌致病中的关键生物学功能。如果能够破坏辣椒疫霉游动孢子和卵孢子的产生、降低菌丝生长速率，进一步抑制病原菌的致病能力就可以阻断辣椒疫霉正常的病害循环从而控制辣椒疫霉引起的植物疫病的流行。

技术实现思路

1、基于此，通过发明人的研究发现，辣椒疫霉中存在含有ago蛋白保守结构域argon、paz、mid和piwi的生长发育调控蛋白pcago1。该生长发育调控蛋白与辣椒疫霉的菌丝生长速率、孢子囊产量及形态、游动孢子和卵孢子数量密切相关，并且还与辣椒疫霉的致病力相关。因此，可以通过控制生长发育调控蛋白pcago1来阻断辣椒疫霉的正常侵染，达到控制(抑制或阻断)辣椒疫霉病害大规模的传播和流行。

2、因此，本发明提供了一种辣椒疫霉病菌中含有argon、paz、mid和piwi结构域的生长发育调控蛋白，名称为pcago1，是如下a1)或a2)或a3)或a4)：

3、a1)氨基酸序列是如seq id no.2所示的蛋白质；

4、a2)在如seq id no.2所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；

5、a3)将如seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的如seq id no.2所示的蛋白衍生的蛋白质；

6、a4)与如seq id no.2所示的氨基酸序列相似性在75％以上，优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如seq id no.2所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。

7、为了使a1)中的蛋白方便纯化，也可以在如seq id no.2所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；所述标签可以为poly-arg(rrrrr)、poly-his(hhhhhh)、flag(dykddddk)、strep-tag ii(wshpqfek)、c-myc(eqkliseedl)等标签。

8、上述a1)-a4)中的生长发育调控蛋白一般来源于自然界中辣椒疫霉病菌中，即一般来讲，其为天然产物，也可以人工表达或者合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a2)-a4)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中seq id no.2所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上述标签的编码序列得到。其中，序列表中seq id no.2(pcago1)由933个氨基酸残基组成。

9、本发明目的之二是提供编码所述含有argon、paz、mid和piwi结构域的pcago1蛋白的核酸分子。所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、hnrna或trna等。

10、其中，上述pcago1蛋白的编码基因为如下b1)或b2)或b3)：

11、b1)序列表中seq id no.1所述的核苷酸序列所示的dna分子；

12、b2)与b1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码上述pcago1蛋白的cdna分子或dna分子；

13、b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述pcago1蛋白的cdna分子或dna分子。例如在本发明中，所述生长发育调控蛋白的dna序列包括存在于辣椒疫霉病菌不同菌株(例如辣椒疫霉病菌lt1534菌株)中的生长发育调控蛋白的dna序列。

14、在本发明中，致病调控蛋白的dna序列(编码基因和cdna)可以具体地如seq idno.2所示，序列表中seq id no.1由2799个核苷酸组成，自序列1的5’端第1-2799位核苷酸为编码序列，编码序列表中seq id no.2所示的蛋白质(pcago1)。

15、本发明之三提供了如上任意一种dna序列转录得到的rna序列，优选的，所述rna分子的序列为如下c1)或c2)：

16、c1)如seq id no.1所示的dna序列转录的rna序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如seq id no.1或seq id no.1所示的dna序列转录的rna序列相同功能的rna序列；

17、c2)最优选rna序列为如seq id no.1所示的dna序列转录的rna序列。

18、本发明之四提供与上述的生长发育调控蛋白、编码基因或上述rna分子相关的生物材料，为下述d1)至d10)中的任一种：

19、d1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒；

20、d2)含有权利要求2所述编码基因的重组载体、或含有d1)所述表达盒的重组载体；

21、d3)含有权利要求2所述编码基因的重组微生物、或含有d1)所述表达盒的重组微生物、或含有d2)所述重组载体的重组微生物；

22、d4)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有d1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

23、d5)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物组织、或含有d2)所述表达盒的转基因植物组织；

24、d6)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物器官、或含有d2)所述表达盒的转基因植物器官；

25、d7)抑制权利要求2所述编码基因表达的核酸分子；优选的，所述核酸分子为敲除权利要求2所述编码基因的核酸分子，或者沉默权利要求2所述编码基因的核酸分子，也可以为编码表达靶向待敲除目的基因的sgrna片段，如靶向于pcago1基因的sgrna序列(编码序列)gaatttgaaggacatggtgg；

26、d8)含有或表达d7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系，重组载体可以包括基于crispr/cas9的基因敲除法是将目的基因的donor载体和sgrna及cas9蛋白表达质粒；所述donor载体为含有依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、dodor dna序列(可以为nptii或gfp或rfp等基因序列)和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体。sgrna及cas9蛋白共表达质粒为编码表达靶向待敲除目的基因的sgrna片段和表达cas9蛋白的dna序列的载体，其中，所述待敲除目的基因为pcago1基因，靶向于pcago1基因的sgrna序列(编码序列)为gaatttgaaggacatggtgg。优选的，所述sgrna及cas9共表达质粒是以pyf515载体为出发载体，将pcago1基因的sgrna退火得到的双链sgrna编码序列，插入pyf515载体的nhe i和bsa i酶识别位点之间，得到sgrna及cas9共表达质粒；

27、d9)抑制权利要求3所述rna分子翻译的核酸分子；

28、d10)含有或表达d9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

29、本发明的目的之五是提供所述的生长发育调控蛋白、及其编码基因或权利要求3所述的rna分子或权利要求4所述的生物材料在控制卵菌完全致病力中的应用；优选的，所述卵菌为辣椒疫霉病菌(phytophthora capsici)，最优选为辣椒疫霉病菌(phytophthoracapsici)lt1534。

30、所述应用为下述e1)-e6)中任一种或几种：

31、e1)在调控(降低)辣椒疫霉菌丝生长速率中的应用；

32、e2)在调控(抑制)辣椒疫霉孢子囊产生；

33、e3)在调控(抑制)游动孢子产生中的应用；

34、e4)在调控(降低)辣椒疫霉对寄主的致病性中的应用；

35、e5)在调控(降低)辣椒疫霉侵染寄主能力中的应用；

36、e6)在抑制和/或杀灭辣椒疫霉病菌中的应用。

37、优选的，其中，所述应用中，包括通过抑制seq id no.1所述的编码基因的转录或使其灭活，或抑制所述的rna分子的翻译，或抑制和/或灭活序列表中seq id no.2的pcago1生长发育调控蛋白中的活性来实现e1)-e6)所述的应用。

38、所述应用中，通过抑制如上述的编码基因的转录，或抑制上述的rna序列的翻译，或抑制和/或失活上述pcago1生长发育调控蛋白的活性来调控(降低)辣椒疫霉病菌孢子囊和游动孢子产生，和/或降低菌丝生长速率，和/或降低对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性(致病力)，从而能够抑制或杀灭辣椒疫霉病菌。

39、优选的，所述应用为将辣椒疫霉seq id no.2所示的pcago1蛋白缺失后使辣椒疫霉菌落形态改变、和/或菌丝生长减慢、和/或不能产生孢子囊和游动孢子、和/或致病力降低等；

40、本发明的目的之六为提供所述序列表中seq id no.2所示的pcago1生长发育调控蛋白、所述序列表中seq id no.1所示的编码基因或上述rna分子或上述生物材料或如权利要求5所述的蛋白或者dna在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选辣椒疫霉病菌抑菌和/或杀菌剂中的应用；所述抑菌或杀菌剂可通过抑制或者灭活辣椒疫霉seq id no.2所示的pcago1生长发育调控蛋白使辣椒疫霉菌落形态改变、和/或菌丝生长减慢、抑制辣椒疫霉病菌孢子囊产生、抑制游动孢子产生，和/或降低菌丝生长速率，和/或降低对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性(致病力)，从而能够抑制或杀灭辣椒疫霉病菌。优选的，所述致病调控蛋白的cdna序列为如seq id no.1所示的dna序列。优选的，所述方法用于抑制和/或杀灭辣椒疫霉引起的生产上的卵菌病害。

41、本发明目的之七是提供一种筛选或辅助筛选辣椒疫霉抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述辣椒疫霉病菌，当所述待检测物能够抑制如上dna序列的转录，或抑制如上rna序列的翻译，或抑制和/或失活如上所示pcago1生长发育调控蛋白的活性，则所述待测物质为候选的植物辣椒疫霉抑菌和/或杀菌剂。

42、本发明目的之八是提供一种控制(抑制或阻断)卵菌完全致病力的方法，包括下述步骤：抑制如上述的编码基因的转录，或抑制所述的rna分子的翻译，或抑制和/或失活如上所述的pcago1生长发育调控蛋白的活性；

43、其中，所述控制(抑制或阻断)卵菌完全致病力为和/或抑制(降低)辣椒疫霉病菌的游动孢子产生，和/或者降低辣椒疫霉病菌的菌丝生长速度，和/或使辣椒疫霉菌丝生长速率降低，降低辣椒疫霉病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性(致病力)。

44、本发明还提供降低卵菌侵染寄主能力的方法，是通过权利要求所述的控制完全致病力来降低卵菌侵染寄主能力。

45、上述控制辣椒疫霉病菌完全致病力的方法，通过敲除如上任意一种dna序列，控制所述辣椒疫霉病菌形成完全致病力的方法。所述辣椒疫霉病菌包括辣椒疫霉病菌lt1534菌株。

46、本发明的一个实施方式中，其中上述基因敲除的方法采用基于crispr/cas9的基因敲除法。

47、具体的，基于crispr/cas9的基因敲除法是将目的基因的donor载体和sgrna及cas9共表达质粒转染辣椒疫霉筛选得到所述目的敲除蛋白灭活的重组菌。

48、所述donor载体为含有依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、dodordna序列(可以为nptii或gfp或rfp等基因序列)和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体。

49、sgrna及cas9蛋白共表达质粒为编码表达靶向待敲除目的基因的sgrna片段和表达cas9蛋白的dna序列的载体，其中，所述待敲除目的基因为pcago1基因，靶向于pcago1基因的sgrna序列(编码序列)为gaatttgaaggacatggtgg。

50、优选的，所述sgrna及cas9共表达质粒是以pyf515载体为出发载体，将pcago1基因的sgrna退火得到的双链sgrna编码序列，插入pyf515载体的nhe i和bsa i酶识别位点之间，得到sgrna及cas9共表达质粒。

51、抑制pcago1生长发育调控蛋白质表达和/或活性的物质在制备植物辣椒疫霉病菌抑菌或杀菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。

52、上述应用中，所述pcago1生长发育调控蛋白质表达和/或活性的物质为抑制pcago1生长发育调控蛋白质表达和/或抑制纤维素合酶蛋白质的编码基因的转录和/或抑制pcago1生长发育调控蛋白质的编码基因转录得到的rna分子的翻译的物质。

53、本发明还提供了一种用于扩增辣椒疫霉病菌中pcago1生长发育调控蛋白的引物序列，即用于扩增靶标序列的引物序列，优选所述引物序列如seq id no.1所示。所述辣椒疫霉病菌包括辣椒疫霉病菌lt1534菌株。

54、扩增编码如上生长发育调控蛋白的dna序列全长或其上的任意一段dna序列的一条引物和/或引物对也属于本发明的保护范围。

55、试验证明，本发明所提供的pcago1生长发育调控蛋白在辣椒疫霉自身生长发育过程中起作用。利用peg-cacl2介导的原生质体转化技术并结合crispr/cas9基因编辑技术获得的敲除突变体，其生长发育较野生型亲本菌株而言有明显变化，主要包括：pcago1蛋白缺失后辣椒疫霉菌落形态改变、菌丝生长减慢、不产生孢子囊、游动孢子和卵孢子、不能对烟草叶片致病；因此，辣椒疫霉病菌中pcago1生长发育调控蛋白在辣椒疫霉无性繁殖、有性生殖及侵染等过程均可发挥重要作用。本发明为进一步探究辣椒疫霉病菌的生长发育过程及致病机制提供了技术支持，并未辣椒疫霉引起的植物疫病防治及新型杀菌剂的研发提供了技术基础。